磷脂酶固定化載體材料的研究進(jìn)展

　　摘要: 游離磷脂酶價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性差限制了其應(yīng)用，固定化技術(shù)使酶穩(wěn)定性增強(qiáng)，可以反復(fù)使用，降低了成本，極大地拓寬了酶的應(yīng)用范圍。性能優(yōu)良的固定化酶應(yīng)具備成本低、穩(wěn)定性高和催化活性高等特性。載體材料不僅是固定化酶的重要組成部分，還是影響固定化酶性能的因素之一。對(duì)磷脂酶固定化載體材料主要從無(wú)機(jī)材料、有機(jī)材料、復(fù)合材料以及無(wú)載體 4 個(gè)方面進(jìn)行綜述，并對(duì)磷脂酶固定化載體材料發(fā)展方向予以展望，為固定化磷脂酶研究在載體材料上的選擇提供了參考依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞: 磷脂酶; 固定化; 載體; 材料

　　磷脂酶是一類存在于生物體內(nèi)、能水解甘油磷脂的酶，在油脂中發(fā)揮重要作用。依據(jù)磷脂酶催化磷脂裂解位點(diǎn)的不同分為 5 類: 磷脂酶 A1，磷脂酶 A2，磷脂酶 B，磷脂酶 C 和磷脂酶 D。然而，磷脂酶在自然界中含量低，價(jià)格高昂，在酸、堿、熱和有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，且難以回收利用，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。磷脂酶的固定化成為改進(jìn)這些不足的關(guān)鍵。

　　所謂固定化，就是將水溶性酶通過(guò)物理或化學(xué)方法束縛或者包埋在水不溶性載體中[1]。固定化磷脂酶在保留了磷脂酶特有的高效性和專一性的同時(shí)，也提高了磷脂酶的穩(wěn)定性，極大地降低了成本，工業(yè)化操作變得簡(jiǎn)單，使大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用成為現(xiàn)實(shí)[2]。

　　載體不僅是固定化酶的重要組成部分，還是影響固定化酶性能的因素之一[3]。選擇適宜的載體有利于提高固定化酶的各種性能。關(guān)于載體材料的選擇，可以從以下幾點(diǎn)考慮: 載體物化性質(zhì)，如形狀、大小、孔徑、機(jī)械強(qiáng)度、耐酸堿、耐高溫和耐生物降解能力等; 載體材料的獲得，載體材料廉價(jià)易得，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵; 能否再生，對(duì)于價(jià)格昂貴的載體，再生利用能降低成本，環(huán)保節(jié)能等。合適的載體材料是酶固定化工藝研究的重點(diǎn)。本文對(duì)近幾年來(lái)磷脂酶固定化載體材料進(jìn)行了綜述并予以展望。

　　1 無(wú)機(jī)載體材料

　　無(wú)機(jī)材料是指能從自然界直接獲取的無(wú)機(jī)物或者混合其他物質(zhì)制成的材料。無(wú)機(jī)材料具備廉價(jià)易得、機(jī)械強(qiáng)度大、耐酸堿、耐有機(jī)溶劑、耐微生物腐蝕等優(yōu) 點(diǎn)，但無(wú)機(jī)材料結(jié)構(gòu)難以控制，與 酶 結(jié) 合 能力差。

　　近幾年來(lái)，為獲得理想的無(wú)機(jī)載體材料，學(xué)者們通常會(huì)在無(wú)機(jī)材料表面修飾上活潑的功能基團(tuán)或者利用新的固定化技術(shù)將磷脂酶固定在無(wú)機(jī)材料上。陶明等[4]使用硅烷偶聯(lián)劑 KH550 水溶液對(duì)無(wú)機(jī)材料凹凸棒土進(jìn)行活化，活化后的凹凸棒土用于固定化磷脂酶 A1，顯示出較好的酶活回收率和熱穩(wěn)定性。Li 等[5]利用新的固定化技術(shù)對(duì)磷脂酶進(jìn)行固定化，先使用 5% 的大豆卵磷脂對(duì)磷脂酶 A1 進(jìn)行生物印跡，再通過(guò)無(wú)機(jī)材料硅藻土對(duì)生物印跡后的磷脂酶 A1 固定化，固定化酶在卵磷脂 - 己烷溶液中的活性提高了 30. 9 倍，顯著改善了磷脂酶 A1 在有機(jī)溶劑中的酶學(xué)性質(zhì)。

　　新型無(wú)機(jī)材料也成為固定化磷脂酶的考慮對(duì)象。新型無(wú)機(jī)材料是指近幾年開發(fā)的具有優(yōu)異性能的無(wú)機(jī)材料，如無(wú)機(jī)納米材料、介孔分子篩。無(wú)機(jī)納米材料具備生物相容性良好、比表面積大等優(yōu)點(diǎn)而成為固定化磷脂酶的優(yōu)良載體材料[6]。其中，納米二氧化硅對(duì)大分子物質(zhì)吸附能力強(qiáng)，且含有功能基團(tuán)而受到廣泛關(guān)注。Li 等[7]以納米二氧化硅為核心，通過(guò)吸附、沉淀和化學(xué)交聯(lián)等手段形成“酶網(wǎng)” 覆蓋在其表面。固定化酶的酶活約為游離酶酶活的 1. 15 倍。對(duì)固定化磷脂酶 D 酶學(xué)性質(zhì)研究表明，與游離磷脂酶 D 相比，固定化磷脂酶 D 的熱穩(wěn)定性明顯提高，pH 適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，動(dòng)力學(xué)研究表明固定化酶催化活性和酶與底物親和性增加。在 4 ℃，固定化酶的半衰期為 70 d，約為游離酶的 2. 3 倍。在連續(xù)使用 12 批次后，固定化磷脂酶 D 的初始反應(yīng)速率大于第一批次的 50% ，表明采用該材料固定化的磷脂酶 D 催化活性高，穩(wěn)定性強(qiáng)。介孔分子篩憑借其內(nèi)部孔徑可調(diào)、比表面積大和酶在孔道中易擴(kuò)散等優(yōu)點(diǎn)，成為固定化酶載體材料的熱點(diǎn)。介孔分子篩已被廣泛應(yīng)用于固定化 β - 葡萄糖苷酶[8]、青霉素 G ?；竅9]等，但將其應(yīng)用于固定化磷脂酶的研究仍處于空白。

　　2 有機(jī)載體材料

　　有機(jī)載體材料是直接利用有機(jī)材料或?qū)τ袡C(jī)材料進(jìn)行物理或化學(xué)改性制成的材料。有機(jī)材料包括天然高分子材料和合成高分子材料兩類。

　　2. 1 天然高分子材料

　　天然高分子材料來(lái)源于自然界中，是一種來(lái)源廣泛且取之不竭的可再生資源，具有無(wú)毒環(huán)保、容易改性和生物相容性良好等優(yōu)點(diǎn)，常被作為固定化酶的載體材料。近年來(lái)，常用于磷脂酶固定化的天然高分子材料為天然多糖，如殼聚糖、纖維素和海藻酸鈉等。

　　殼聚糖化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱性好，含大量活性基團(tuán)氨基。孫萬(wàn)成等[10]將殼聚糖、戊二醛與磷脂酶 A1 同時(shí)加入反應(yīng)體系中，使載體、交聯(lián)劑和酶充分接觸，克服了傳統(tǒng)方法導(dǎo)致的酶活回收率偏低的缺陷。與此同時(shí)，固定化磷脂酶 A1 熱穩(wěn)定性明顯提高，pH 向堿性偏移，動(dòng)力學(xué)反應(yīng)表明固定化酶與底物親和力增強(qiáng)，有利于酶促反應(yīng)。

　　纖維素不易被微生物分解，且含有大量羥基，羥基能通過(guò)化學(xué)反應(yīng)帶有多種活潑的官能團(tuán)，而與酶上的官能團(tuán)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)固定化酶。于殿宇等[11]以高碘酸鈉活化的纖維素濾紙膜固定化磷脂酶 A1。與游離磷脂酶 A1 相比，固定化磷脂酶 A1 的 pH 耐受性和溫度穩(wěn)定性增強(qiáng)。重復(fù)使用 7 次后，固定化磷脂酶 A1 催化活性仍有初始活性的 65% 以上。 Fbd 等[12]以三醋酸纖維素作為載體固定化磷脂酶，三醋酸纖維素比普通的纖維素更疏水，在脂肪酶固定化中表現(xiàn)出良好的性能，是固定化磷脂酶的良好候選載體材料。磷脂酶 A1 在三醋酸纖維素中的固定化率在 60 min 內(nèi)達(dá)到 97. 1% ，酶活為 975. 8 U /g。固定化后的磷脂酶 A1 具有良好的熱穩(wěn)定性和 pH 穩(wěn)定性。

　　天然高分子材料安全無(wú)毒，符合綠色生產(chǎn)的要求，與酶結(jié)合能力良好，固定化條件溫和，操作簡(jiǎn)易，具有廣闊的應(yīng)用前景。天然高分子材料固定化磷脂酶已被成功應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，如陳麗萍等[13]將海藻酸鈉固定的磷脂酶 A1 應(yīng)用于大豆油脫膠，脫膠后測(cè)得大豆油中磷含量為 9. 87 mg / kg，符合油脂中低磷含量要求。

　　2. 2 合成高分子材料

　　合成高分子材料具備機(jī)械強(qiáng)度高、物理化學(xué)性質(zhì)確定等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者們的喜愛。應(yīng)用于磷脂酶固定化的合成高分子材料主要為合成樹脂類，合成樹脂大多通過(guò)簡(jiǎn)單的吸附作用與磷脂酶結(jié)合，對(duì)酶結(jié)構(gòu)的破壞較小。

　　Liu 等[14]以陰離子交換樹脂 D202 固定化磷脂酶 A1，酶活達(dá)到 1 682 U /g，酶活殘留率為 33. 0% 。利用固定化酶催化大豆油甘油解生產(chǎn)功能性食用油甘油二酯( DAG) ，在 45 ℃ 反應(yīng) 12 h，DAG 產(chǎn)量為 53. 9% ，與游離酶( 54. 7% ) 接近。固定化酶連續(xù)使用 28 批次后，DAG 產(chǎn)量為 31. 8% ，而游離酶在連續(xù)使用 10 次 后，DAG 產(chǎn) 量 僅 21. 9% 。Li 等[15] 以 D380 樹脂對(duì)磷脂酶 A1 進(jìn)行固定，得到的固定化酶活力為 720. 95 U /g。利用酯交換反應(yīng)體系催化合成 DHA /EPA 型磷脂，固定化磷脂酶 A1 的催化效果遠(yuǎn)高于游離磷脂酶 A1。反應(yīng) 24 h 后，以固定化磷脂酶 A1 作為催化劑，DHA /EPA 總結(jié)合率為 19. 5% ，然而以游離磷脂酶 A1 作為催化劑，DHA /EPA 的總結(jié)合率僅為 7. 4% 。固定化酶重復(fù)使用 6 次后，殘存的酶活力仍可達(dá)到 48. 9% 。聚苯乙烯二乙烯苯樹脂[16]和 D001 樹脂[17]也被用于磷脂酶的固定化研究。

　　以上結(jié)果表明，合成樹脂固定化磷脂酶催化活性優(yōu)良，將其應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，產(chǎn)品產(chǎn)量及固定化磷脂酶重復(fù)使用性均優(yōu)于游離酶。此外，合成樹脂固定化磷脂酶還被用于大豆油脫膠[18]、催化制備果糖月 桂 酸 單 酯[19]、DHA 型 磷 脂[20]、磷 脂 酰 絲 氨酸[21]、富含共軛亞油酸磷脂[22]等中。

　　3 復(fù)合載體材料

　　復(fù)合材料是一種混合物，由兩種或兩種以上材料通過(guò)物理或者化學(xué)手段組合而成。復(fù)合材料的性能不單是簡(jiǎn)單地單一材料性能的相加，還可能通過(guò)復(fù)合效應(yīng)產(chǎn)生原材料不具備的新性能。常見的固定化磷脂酶復(fù)合材料包括天然高分子復(fù)合材料、合成 - 天然高分子復(fù) 合 材 料 以 及 無(wú) 機(jī) - 有 機(jī) 復(fù) 合材料。

　　3. 1 天然高分子復(fù)合材料

　　將天然高分子材料如海藻酸鈉、殼聚糖和明膠組合是常見的固定化磷脂酶材料，如海藻酸鈉和殼聚糖復(fù)合物固定化磷脂酶 A1 [23]、磷脂酶 A2 [24]，海藻酸鈉和明膠復(fù)合物固定化磷脂酶 A1 [25]，最大酶活回收率均大于 60% ，重復(fù)使用性優(yōu)良。與游離磷脂酶相比，固定化后磷脂酶的熱、pH 穩(wěn)定性均得到提高。張智等[26]分別采用海藻酸鈉、海藻酸鈉 - 殼聚糖和海藻酸鈉 - 明膠為載體固定化磷脂酶 A1。重復(fù)使用 4 次后，兩種復(fù)合材料固定化磷脂酶 A1 的相對(duì)酶活仍保留在 80% 左右，而以單一材料為載體固定化磷脂酶 A1 的相對(duì)酶活僅剩 50% 。研究表明，復(fù)合材料固定化磷脂酶的操作穩(wěn)定性高于單一材料固定化磷脂酶。

　　復(fù)合天然高分子材料提高了酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用率，擴(kuò)大了固定化磷脂酶的應(yīng)用范圍。目前，復(fù)合天然高分子材料固定化磷脂酶主要用于油脂脫膠，如海藻酸鈉和殼聚糖的復(fù)合材料固定化磷脂酶用于大豆油脫膠[27]和菜籽油脫膠[28]，海藻酸鈉和明膠的復(fù)合材料固定化磷脂酶用于冷榨菜籽油脫膠[29]，脫膠效果均較好。

　　3. 2 合成 - 天然高分子復(fù)合材料

　　合成 - 天然高分子復(fù)合材料固定化磷脂酶，兼具合成高分子材料和天然高分子材料的優(yōu)點(diǎn)。時(shí)敏等[30]將纖維素衍生物醋酸纖維素制成鑄膜液，涂在聚四氟乙烯基膜表面，得到復(fù)合膜固定化磷脂酶 A1。聚四氟乙烯基膜為多孔狀結(jié)構(gòu)，有利于酶分子的附著，醋酸纖維素提供活性基團(tuán)。固定化磷脂酶 A1 的最大酶活力為 4. 0 U /cm2 。Zhan 等[31]將一定量的磷脂酶 A1 溶液加入充分溶解的海藻酸鈉和聚乙烯醇溶液中，然后注入硼酸和氯化鈣混合溶液中，浸泡若干分鐘，形成微球。聚乙烯醇提高了微球的機(jī)械強(qiáng)度，海藻酸鈉形成多孔結(jié)構(gòu)有利于磷脂酶 A1 進(jìn)入且能抑制微球聚集在一起。固定化磷脂酶 A1 最高 酶 活 達(dá) 到 126. 50 U /g，固定化效率達(dá)到 85. 32% 。重復(fù)使用 8 次后，固定化磷脂酶 A1 仍然保留了 50. 37% 的初始酶活。在 4 ℃儲(chǔ)存 6 周后，固定化磷脂酶 A1 酶活為初始酶活的 78. 58% 。

　　固定化酶的催化活性、重復(fù)使用性和操作穩(wěn)定性都較好，且結(jié)合了兩種材料的優(yōu)點(diǎn)，但目前對(duì)于合成 - 天然高分子材料固定化磷脂酶的研究較少。

　　3. 3 無(wú)機(jī) - 有機(jī)復(fù)合載體材料

　　無(wú)機(jī) - 有機(jī)復(fù)合材料固定化磷脂酶，多采用有機(jī)高分子材料包裹無(wú)機(jī)納米粒子形成納米復(fù)合微球固定化磷脂酶。梁江[32]以殼聚糖包裹納米二氧化硅為載體固定化磷脂酶 D，納米二氧化硅提供核，殼聚糖提供大量活性基團(tuán)。固定化酶催化效率是游離酶的 1. 16 倍，pH 耐受性變寬; 重復(fù)使用 7 次后，仍有 60%的殘余酶活; 保存 70 d 后，酶活剩余 50%。

　　復(fù)合納米微球催化活性、操作和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性均良好，但復(fù)合納米微球從反應(yīng)體系中分離回收困難，易造成損失[33]。磁性納米微球由磁性納米粒子與有機(jī)材料復(fù)合而成。磁性納米粒子表面可通過(guò)包裹或接枝作用結(jié)合含多種功能基團(tuán)的有機(jī)材料。通過(guò)外部磁鐵作用，固定化酶與反應(yīng)體系能快速分離; 撤除外部磁鐵，固定化酶能穩(wěn)定懸浮在反應(yīng)體系中。因此，磁性納米微球是良好的固定化酶材料[34]。

　　Yu 等[35]使用 Fe3O4 / SiOx - g - P( GMA) 磁性納米微球固定化磷脂酶 A1，掃描電子顯微鏡結(jié)果表明形成的納米微球直徑約為 250 nm。在最優(yōu)條件下，固定化效率為64. 7% ，酶活為2 066. 67 U /g。與游離磷脂酶 A1 相比，固定化磷脂酶 A1 的 pH 和溫度穩(wěn)定性更好。將固定化酶用于大豆油脫膠，脫膠 7 h 后，脫膠油中磷含量為 9. 6 mg / kg，低于傳統(tǒng)的水化脫膠( < 10 mg / kg) 。55 ℃ 脫膠 10 次后，殘余酶活為初始酶活的 80% 以上。Qu 等[36]使用該載體固定化磷脂酶 A2，得到的酶固載率及催化活性最大，分別為 122. 60 mg /g 和 1 289 U /g，用于大豆油脫膠，脫膠油磷含量為 9. 8 mg / kg，使用 5 次后，酶活損失較小。目前，磁性納米微球越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視，如固定化堿性蛋白酶[37]、脂肪酶[38 - 39]，但將磷脂酶固定在磁性納米粒子上的研究并不多見。

　　4 無(wú)載體———交聯(lián)酶聚集體( CLEAs)

　　CLEAs 不需要載體，操作簡(jiǎn)單，酶活性中心未被破壞，酶活回收率極高，極 具 開 發(fā) 價(jià) 值[40]。魚園[41] 以磷 脂 酶 D 制 備 CLEAs，最大催化活性為 15. 62 U /mg，酶活回收率為 86% ，重復(fù)使用 10 個(gè)批次后，酶活為初始酶活的 55% 。然而，無(wú)載體固定化酶難以回收、機(jī)械強(qiáng)度差，因此人們考慮對(duì) CLEAs 進(jìn)行改進(jìn)。王妍等[42]將磷脂酶 A1 制備成 CLEAs，然后使用海藻酸鈣凝膠進(jìn)行包埋，增強(qiáng)了機(jī)械強(qiáng)度，克服了其不易回收的缺陷。固定化酶的耐熱性高于游離酶，且更耐堿; 重復(fù)使用 6 個(gè)批次后，固定化酶酶活仍保持 65% 以上。

　　5 結(jié)束語(yǔ)

　　對(duì)磷脂酶固定化載體材料的研究從未停止，由早期的單一材料發(fā)展到復(fù)合材料，由直接使用自然界的已有材料到對(duì)已有材料進(jìn)行改性和使用新型材料，有效提高了磷脂酶的穩(wěn)定性和催化活性，擴(kuò)大了磷脂酶的應(yīng)用范圍。對(duì)磷脂酶固定化載體材料的選擇，需要綜合考慮多方面因素，包括載體材料的來(lái)源、理化性質(zhì)、應(yīng)用環(huán)境等，優(yōu)良的載體材料需要與酶及應(yīng)用相匹配。隨著化工、材料和生物技術(shù)的發(fā)展，根據(jù)磷脂酶特性和固定化需要設(shè)計(jì)制備性能優(yōu)良的載體將成為磷脂酶固定化材料的重要選擇方向，這需要研究者們更深入掌握磷脂酶的物化特性和應(yīng)用環(huán)境。

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《磷脂酶固定化載體材料的研究進(jìn)展》

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