N-端修飾提高D-氨基酸氧化酶的表達(dá)酶活

　　摘要：通過(guò)提高DAAO的酶活來(lái)進(jìn)一步提高本研究的多酶轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化效率。本章通過(guò)對(duì)來(lái)源于Rhodosporidiumtoruloides的DAAO（RtDAAO）的N-端進(jìn)行研究，并通過(guò)一系列的改造和修飾，提高了RtDAAO在E.coli中的可溶性表達(dá)，同時(shí)又保證了宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)，以便于表達(dá)后重組菌的收集和多酶級(jí)聯(lián)體系的制備。

　　關(guān)鍵詞：N-端；DAAO；酶活

　　1.多酶級(jí)聯(lián)體系轉(zhuǎn)化過(guò)程速率分析

　　為了準(zhǔn)確建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及的反應(yīng)速率及相應(yīng)的底物及產(chǎn)物必須進(jìn)行詳細(xì)的分析。如圖1所示，本文研究的級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)化體系涉及四個(gè)酶，五個(gè)反應(yīng)速率過(guò)程。根據(jù)反應(yīng)體系設(shè)計(jì)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程主要分為兩步，第一步所用的酶為D-氨基酸氧化酶（DAAO）和過(guò)氧化氫酶（CAT），混旋底物中的D-正纈氨酸經(jīng)DAAO氧化生成前手性物2-氧代戊酸。DAAO的反應(yīng)過(guò)程除了底物涉及到輔酶FAD用于氫負(fù)離子的傳遞，同時(shí)需要氧氣重新氧化FADH2，使得DAAO具有活性，重新加入反應(yīng)過(guò)程中。其中FAD與酶緊密結(jié)合，不需要外源添加，因此氧氣的供應(yīng)對(duì)DAAO的活性具有重要的意義，是本反應(yīng)需要考慮的重要因素之一。而氧氣的供應(yīng)受到從氣體到液相的傳質(zhì)的限制，所以DAAO的酶活提高與底物氧化的速率提高的幅度才出現(xiàn)了不對(duì)等的情況。CAT的作用是用于消除反應(yīng)副產(chǎn)物H2O2，同時(shí)也能夠回收一部分氧氣直接參與DAAO的反應(yīng)。所以，如圖第一步涉及的反應(yīng)速率記為r1和r2。第二步所用的酶是亮氨酸脫氫酶（LDH）和甲酸脫氫酶（FDH），這一步涉及三個(gè)反應(yīng)速率記為r3，r4和r5。LDH在催化酮酸的不對(duì)稱還原胺化反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，雖然反應(yīng)平衡傾向于合成氨基酸方向，為了準(zhǔn)確描述轉(zhuǎn)化過(guò)程，其逆反應(yīng)也是需要考慮在內(nèi)，所以需考慮r3和r4。FDH用于合成輔酶NADH，與亮氨酸脫氫酶形成輔酶循環(huán)，使得反應(yīng)得以進(jìn)行，因此對(duì)于轉(zhuǎn)化過(guò)程的描述也需要考慮其反應(yīng)速率r5。從整體的轉(zhuǎn)化來(lái)看，本文研究的轉(zhuǎn)化體系涉及到很多副產(chǎn)物小分子的體系內(nèi)回收利用，如氧氣、NH3及輔酶NADH等。

　　2.動(dòng)力學(xué)參數(shù)

　　在建立動(dòng)力學(xué)模型的基礎(chǔ)上，為了使該模型能夠得到應(yīng)用，需要進(jìn)一步測(cè)定模型中的所有動(dòng)力學(xué)參數(shù)。同時(shí)，參數(shù)測(cè)定的準(zhǔn)確性也會(huì)影響到模型描述轉(zhuǎn)化過(guò)程的準(zhǔn)確性及其預(yù)測(cè)結(jié)果。因此，所有參數(shù)的測(cè)定條件是在L-正纈氨酸的最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行的。利用初始速率法測(cè)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)，涉及反應(yīng)的化合物對(duì)初始速率的影響均被測(cè)量。DAAO的動(dòng)力學(xué)測(cè)定數(shù)據(jù)及方程擬合，可以看出產(chǎn)物2-氧代戊酸對(duì)DAAO的抑制。同時(shí)，DAAO不受底物D-正纈氨酸的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體的抑制。該反應(yīng)可以回收部分氧氣。LDH催化的可逆反應(yīng)是本體系轉(zhuǎn)化的第二步反應(yīng)，可以看出，正向反應(yīng)不僅受到產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，同時(shí)高濃度底物對(duì)其也有抑制作用，因此轉(zhuǎn)化體系最好不要有過(guò)多的中間產(chǎn)物2-氧代戊酸的積累。由于反應(yīng)平衡偏向于正向反應(yīng)，所以產(chǎn)物L(fēng)-正纈氨酸的氧化脫氨基本可以忽略不計(jì)。最后是輔酶NAD再生循環(huán)的反應(yīng)速率，其大小影響到了LDH的正向反應(yīng)，因此，在轉(zhuǎn)化體系中具有重要的作用。

　　3.模型的準(zhǔn)確性驗(yàn)證

　　模擬結(jié)果中D-正纈氨酸的消耗曲線基本能夠很好的與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相擬合。同時(shí)模擬結(jié)果也顯示了轉(zhuǎn)化過(guò)程中間產(chǎn)物2-氧代戊酸的積累，由于實(shí)驗(yàn)測(cè)量無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)控，所以并不知道中間產(chǎn)物在哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到最大積累量。然而模型模擬可以顯示在D-正纈氨酸剛被消耗完也就是轉(zhuǎn)化時(shí)間不到2h的時(shí)候，中間產(chǎn)物的積累達(dá)到最高峰。該結(jié)果可以看出由于DAAO快速氧化D-正纈氨酸導(dǎo)致2-氧代戊酸大量合成，而轉(zhuǎn)化體系第二步由于NADH供應(yīng)不足來(lái)不及胺化還原第一步產(chǎn)生的2-氧代戊酸，使得中間產(chǎn)物逐漸積累并在底物消耗完的時(shí)間左右達(dá)到了最高峰。因此，想要進(jìn)一步提高體系的轉(zhuǎn)化效率，關(guān)鍵是提高轉(zhuǎn)化體系第二步的效率，也就是提高FDH的酶活，加強(qiáng)NADH的供應(yīng)。通過(guò)N-端修飾提高了DAAO的酶活而的轉(zhuǎn)化速率卻沒有獲得相應(yīng)比例的提高，是由于轉(zhuǎn)化過(guò)程中存在制約因素即氧氣的供應(yīng)。因此，在提高FDH酶活前，需要通過(guò)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果來(lái)提高FDH的酶活，避免過(guò)多的提高導(dǎo)致無(wú)用的活性。

　　4.模型預(yù)測(cè)

　　綜合上述對(duì)體系不同酶量組別轉(zhuǎn)化組別的分析可知，目前體系中甲酸脫氫酶酶活無(wú)法達(dá)到最佳轉(zhuǎn)化的條件，同時(shí)也計(jì)算得出在有充足的DAAO和LDH條件下，F(xiàn)DH在體系中酶活至少要達(dá)到4.67×102U/L，同時(shí)，進(jìn)一步提高FDH的酶活，則DAAO和LDH的活性可以適當(dāng)?shù)慕档偷且ＷC位于預(yù)測(cè)的范圍。所以，最佳體系還需根據(jù)改造后FDH的最終酶活進(jìn)行調(diào)整。

　　5.結(jié)論

　　據(jù)測(cè)得的參數(shù)數(shù)值使用模型，模擬得到的結(jié)果與在相同條件下的L-正纈氨酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本吻合，證明本研究所構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型能夠準(zhǔn)確地描述L-正纈氨酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程，可以用來(lái)預(yù)測(cè)L-正纈氨酸轉(zhuǎn)化從而指導(dǎo)多酶級(jí)聯(lián)體系中酶表達(dá)比例的優(yōu)化。

　　利用已驗(yàn)證的數(shù)學(xué)模型模擬預(yù)測(cè)不同DAAO和FDH酶量體系的轉(zhuǎn)化速率及過(guò)程中間產(chǎn)物積累量得到最佳轉(zhuǎn)化體系要求DAAO和FDH的范圍和兩者的最少酶活。同時(shí)，也預(yù)測(cè)了不同LDH和FDH酶量體系的轉(zhuǎn)化速率及轉(zhuǎn)化結(jié)束中間產(chǎn)物含量來(lái)進(jìn)一步得到高轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)化效率的體系。綜合兩組預(yù)測(cè)，F(xiàn)DH的最低酶活為4.67×102U/L，同時(shí)模擬得到的酶活范圍表明，最佳體系中DAAO和LDH的酶活可以隨FDH的酶活提高而適當(dāng)降低。

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