柑橘果酒中的類檸檬苦素及其脫除方法綜述

　　摘要：類檸檬苦素是引起柑橘果酒后苦味的重要因素，綜述了類檸檬苦素的結(jié)構(gòu)、功能、苦味產(chǎn)生機理以及近年來國內(nèi)外脫除檸檬苦素類化合物的有效方法，為柑橘果酒脫苦工藝的發(fā)展提供依據(jù)。。

　　關(guān)鍵詞：柑橘果酒;檸檬苦素類化合物;脫苦;綜述

　　柑橘(Citrus)是世界第一大水果，我國是柑橘的主要原產(chǎn)國。2017年，我國柑橘種植面積為262.3萬hm2，產(chǎn)量達(dá)3931萬t，均排世界第一，目前栽種的品種主要有金橘、溫州蜜橘、椪柑、砂糖橘、臍橙等。柑橘的采收時期集中，經(jīng)常會出現(xiàn)鮮果滯銷、柑橘賣難等情況，從而造成一定的經(jīng)濟損失[1]。為了解決鮮果供過于求的問題，人們通常會將柑橘加工成食品，如柑橘罐頭、柑橘酒等。

　　柑橘果酒(CitrusFruitWine)是以柑橘為原料經(jīng)酵母發(fā)酵產(chǎn)生酒精和相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的一種飲料酒。柑橘果酒具有典型性香氣，富含VA、VC和黃酮等活性成分，有利于人體的健康。目前柑橘果酒產(chǎn)業(yè)化加工較少，主要原因是柑橘加工后會產(chǎn)生苦味。這類苦味物質(zhì)嚴(yán)重影響了柑橘果酒的口感，給消費者帶來不愉快的體驗[2]。柑橘中的苦味物質(zhì)主要有2種，黃烷酮糖苷類化合物(Flavanoneglycosidecompounds，如柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等)和檸檬苦素類化合物(Limonoids，如檸檬苦素、諾米林等)。柚皮苷苦味閾值較高，水溶液中閾值為20mg/L，主要存在于葡萄柚和苦橙中。檸檬苦素苦味閾值很低，水溶液中閾值為1.0mg/L，果汁中苦味閾值3.4mg/L，約為柚皮苷苦味閾值的20倍，因此柑橘果汁及果酒的“后苦”現(xiàn)象，主要是由檸檬苦素引起的[3-4]。該文主要概述近年來國內(nèi)外有關(guān)柑橘果酒脫除類檸檬苦素苦味的最新研究進展，指出其存在的主要問題，并對其發(fā)展動態(tài)進行展望，以期為解決柑橘果酒加工苦味的瓶頸難題提供新思路，為我國果酒加工相關(guān)研究提供參考。

　　1檸檬苦素類化合物簡介

　　1.1檸檬苦素類化合物的結(jié)構(gòu)

　　檸檬苦素類化合物也稱為類檸檬苦素，是蕓香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物的主要次生代謝產(chǎn)物，是一類高度氧化修飾的萜烯類化合物。1841年，科學(xué)家從柑橘中首次分離得到檸檬苦素[5]，到了20世紀(jì)60年代，科學(xué)家通過化學(xué)和X射線衍射的方法，確認(rèn)了檸檬苦素的結(jié)構(gòu)[6]，得到其分子式為C26H30O8，相對分子質(zhì)量為470。類檸檬苦素是立體結(jié)構(gòu)的配位化合物，其原型結(jié)構(gòu)包含或源自一種具有4，4，8-三甲基-17-呋喃類固醇骨架的前體。所有天然存在的柑橘類檸檬苦素都含有一個呋喃環(huán)，在C-17處與D環(huán)相連接，C-3、C-4、C-7、C-16和C-17處均含有含氧官能團[7]。檸檬苦素類化合物主要存在于柑橘的果實、種子中，種子中含量最高[8]。檸檬苦素類似物種類豐富，主要包括檸檬苦素(Limomin)、諾米林(Nomilin)、脫乙酰諾米林(Deacetylnomilin)、諾米林酸(NomilinicAcid)等[9]。迄今為止已分離出大約300種檸檬苦素類化合物，而在柑橘屬中已分離出38種檸檬苦素類似物和21種配糖體[10]。目前已經(jīng)分離出的這38種檸檬苦素類似物中，表現(xiàn)出苦味的僅有6種，其中檸檬苦素的苦味最強[11]，其次是諾米林，類檸檬苦素的脫苦工藝就是將這些物質(zhì)的含量降低。

　　1.2檸檬苦素類化合物的功能

　　檸檬苦素類化合物具有抗腫瘤、抗炎等生理活性[12]。Miller等[13]發(fā)現(xiàn)某些柑橘類檸檬苦素可抑制7，12-二甲基苯[a]炭疽桿菌誘導(dǎo)的口腔腫瘤發(fā)生。Wang等[14]通過試驗首次發(fā)現(xiàn)類檸檬苦素具有較高的抗氧化生物活性。Tian等[15]研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞中，檸檬苦素類化合物可抑制雌激素受體陰性和陽性細(xì)胞的生長，具有抗癌細(xì)胞增殖作用。檸檬苦素類化合物在水果中以糖苷和苷元的形式存在，Poulos等[16]評價了其對2種人類癌細(xì)胞系(SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤和Caco-2結(jié)腸腺癌)以及一種非癌哺乳動物上皮中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的毒性作用，通過3-[4，5-二甲基噻唑-2-?；鵠-2，5-二苯基四氮唑還原和光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞暴露于苷元(即檸檬苦素、諾米林)后，活性顯著降低。SH-SY5Y細(xì)胞較Caco-2細(xì)胞對檸檬苦素更敏感，而非癌性CHO細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞形態(tài)上幾乎沒有變化，說明類檸檬苦素對腫瘤細(xì)胞具有較強的多方面殺傷作用，但對CHO細(xì)胞的殺傷效果相對較差。檸檬苦素除了具有上述功能外，還具有抗氧化、預(yù)防心腦血管以及利尿等功效。

　　1.3檸檬苦素類化合物的苦味產(chǎn)生機理

　　柑橘成熟后檸檬苦素含量非常少，新鮮的果實或者鮮榨的柑橘汁都沒有苦味，放置一段時間或者經(jīng)過加工處理之后就會產(chǎn)生苦味。研究證明，果實正常成熟過程中，檸檬苦素前體物質(zhì)檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯(LimonoidA-ringLactone，LARL)逐漸被檸檬苦素UDP-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶(Limonoid-UDP-glycosylTransferases，LGT)糖基化為配糖體(LG)[17]，此時是不具有苦味的。而當(dāng)果實受到一定的機械損傷等外界環(huán)境脅迫時，LARL在檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下迅速轉(zhuǎn)化為具有強烈苦味的檸堿[3，18-19]。

　　2柑橘果酒中檸檬苦素類化合物的掩蓋或脫除方法

　　盡管檸檬苦素類化合物具有很多的生理功能，有利于人體的身體健康，但是其嚴(yán)重影響柑橘果酒的風(fēng)味，從而制約柑橘果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。最大程度掩蓋或者脫除柑橘果酒中的苦味物質(zhì)是發(fā)展該產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。

　　2.1添加苦味抑制劑掩蓋苦味

　　苦味抑制劑主要是通過阻塞苦味受體、截斷苦味信號傳遞等方式來降低或消除苦味[20]。添加苦味抑制劑可以掩蓋柑橘果酒中的檸檬苦素類化合物產(chǎn)生的后苦味，起到有效麻痹味覺細(xì)胞，提高苦味感受閾值的作用[21]。蔗糖是常用的苦味抑制劑，但效果不明顯，而添加量過高會損害人體健康。β-環(huán)糊精由7個葡萄糖殘基以α-1，4-糖苷鍵連接而成，具有親水的外圍和疏水的內(nèi)腔，在溶液中可與多種有機物形成包合物，研究表明其可用于掩蓋柑橘中的苦味[22]。0.05%~0.50%的β-環(huán)糊精對柑橘果酒脫苦效果較好。另外，新地奧明也是比較理想的苦味抑制劑。該物質(zhì)是新橙皮苷脫氫獲得的一類黃酮物質(zhì)，能夠起到掩蓋苦味、調(diào)和風(fēng)味的作用。將新地奧明加入到果酒中，它能與檸檬苦素或諾米林競爭而結(jié)合到苦味受體分子上，最終使苦味閾值增大[23]。研究發(fā)現(xiàn)，柑橘果酒中添加60mg/kg的新地奧明，可以使苦味閾值從3.4mg/kg升高至6.8mg/kg[24]。

　　目前，市場上出現(xiàn)了許多新型甜味劑。新橙皮苷二氫查爾酮(NeohesperidinDihydrochalcone，NHDC)是一種黃酮類衍生物，從天然柑橘等植物中提取出來經(jīng)過氫化而成[25]。這種甜味劑甜度是蔗糖的1500~1800倍，而且口感清爽、余味持久，改善口味及屏蔽苦味的功效極佳，常用來改善食品與飲料味道[26]。但是，目前單一的苦味抑制劑無法全面抑制檸檬苦素類化合物的苦味。

　　2.2優(yōu)化工藝降低苦味

　　柑橘果酒的風(fēng)味受很多工藝的影響，例如鮮果的成熟度和榨汁方式等。因此實驗室通常挑選比較成熟的柑橘，通過慢速打漿或者鈍刀打漿的方式讓成品更加清甜可口[27]。果肉的含量也需要嚴(yán)格控制，可以采用離心分離的方法去除果肉顆粒[28]。目前，低醇發(fā)酵、低溫貯藏是未來的發(fā)展趨勢，不僅滿足消費者對低酒精度飲料酒的需求，同時低醇發(fā)酵、低溫貯藏生產(chǎn)的柑橘果酒含有較少的檸檬苦素，成品酒的口感較好。研究表明，柚子果汁經(jīng)濃縮和4℃貯藏4d，離心后檸檬苦素含量分別下降17%和31%[29]。

　　2.3吸附法脫苦

　　吸附法是商業(yè)上常用的脫苦方法，其操作簡單、成本低、處理時間短，處理溫度低、吸附過程中不產(chǎn)生其他的雜質(zhì)?；钚蕴?、硅膠、離子交換樹脂等是生產(chǎn)中常用的吸附劑。但是吸附劑容易飽和、阻塞、再生時間較長，吸附后營養(yǎng)成分會有一定的損失。

　　Zhang等[30]首次以表面分子印跡聚合物(SMIPs)為吸附劑從檸檬汁中去除檸檬苦素。結(jié)果表明，與表面分子非印跡聚合物(SNiPs，8.12mg/g)相比，SMIPs(27.72mg/g)具有更高的吸附容量，并且該吸附劑對檸檬苦素具有更好的選擇識別作用，最終從檸檬汁中吸附了幾乎所有的檸檬苦素。張曉丹等[31]

　　通過單因素試驗和正交優(yōu)化試驗，得出在4%樹脂、溫度25℃、時間25min、轉(zhuǎn)速100r/min的工藝條件下，椪柑酒中檸檬苦素和諾米林的含量分別降低了49.54%和33.69%，VC的損失率僅為25.12%，說明X16樹脂對苦味物質(zhì)的脫除有顯著效果，并且對營養(yǎng)成分的損失較小。Bao等[32]采用大孔吸附樹脂EXA-45和LX-900對果汁進行吸附脫苦，發(fā)現(xiàn)EXA-45比LX-900具有更高的吸附容量和更快的吸附速率，表明EXA-45比LX-900的應(yīng)用前景更好。因此在實際應(yīng)用中，選擇高效的吸附材料有利于提高吸附性能和吸附效率。

　　2.4酶法脫苦

　　酶法脫苦主要是通過相應(yīng)的酶作用于檸檬苦素，使之生成不含苦味的物質(zhì)。酶法脫苦專一性強、效率高，并且對果酒中的營養(yǎng)成分損失少[33]。檸檬苦素脫苦酶主要有檸酸A-環(huán)內(nèi)脂脫氫酶(LimonateA-cyclicLipidDehydrogenase)、檸檬苦素環(huán)氧酶(LimoninEpoxidase)、乙酰基裂解酶(Acetyl-lyase)、檸檬苦素醇脫氫酶(Limoninalcoholdehydrogenase)和反式消除酶(Transeliminase)等。將檸酸A-環(huán)內(nèi)脂或檸檬苦素轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)就可減輕苦味。檸酸A-環(huán)內(nèi)脂脫氫酶可將檸酸A-環(huán)內(nèi)脂轉(zhuǎn)化為無苦味的17-脫氫檸酸A-環(huán)內(nèi)脂，檸檬苦素環(huán)氧酶可將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為沒有苦味的脫氧檸檬苦素，檸檬苦素醇脫氫酶可以將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為檸檬苦素醇，而反式消除酶則可將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為沒有苦味的反-19-羥基黃柏酮酸[34]。這些酶對諾米林的作用方式與對檸檬苦素的作用方式相似，其中乙?；呀饷复媪朔词较缸饔糜谥Z米林，將其轉(zhuǎn)化成黃柏酮。

　　果酒中含有大量的有機酸，pH值偏酸性，而檸檬苦素類化合物脫苦酶的最適pH值通常偏堿性，脫苦之前需要先調(diào)節(jié)柑橘果酒的pH值，而這將影響柑橘果酒的風(fēng)味[35-36]。同時，利用酶法脫苦還需面臨酶的提取純化問題。若將產(chǎn)生這些酶的細(xì)菌細(xì)胞先固定化，再用于柑橘果酒的脫苦，可以減少酶的提純工作。目前，常用的細(xì)菌有球形節(jié)桿菌、假單胞菌和束紅球菌等[36]。高秋芬等[37]研究黑曲霉胞外酶對琯溪蜜柚果汁的脫苦作用，結(jié)果表明，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵12d，檸檬苦素的去除率達(dá)到27.7%;液態(tài)發(fā)酵10d，檸檬苦素的去除率達(dá)到30.8%。這說明黑曲霉胞外酶液可顯著降低檸檬苦素的含量，達(dá)到有效脫苦的目的，同時也可初步確定黑曲霉胞外酶液中含有檸檬苦素類脫苦酶，可用于柑橘成品脫苦。Hasegawa等[38]利用果糖、半乳糖和檸檬酸等廉價碳源制備了能代謝檸檬苦素的棒狀桿菌細(xì)胞，然后將棒狀桿菌細(xì)胞在丙烯酰胺凝膠中固定化，再用于開發(fā)生物脫苦技術(shù)。該工藝顯著降低了柑橘汁中的檸檬苦素和諾米林的含量，尤其是降低諾米林含量的效果理想，而且脫苦處理對檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、果糖、葡萄糖、蔗糖等其他柑橘成分無不良影響，可以用于柑橘果酒的脫苦。

　　酶法脫苦具有許多的優(yōu)點，但是成品酶或菌種的篩選及培養(yǎng)主要還停留在實驗室階段。

　　2.5膜分離技術(shù)脫苦

　　膜分離技術(shù)也是目前研究較多的一種脫苦方式，其分離效率高、操作溫度低、處理量大，可用于連續(xù)化生產(chǎn)[34，39]。按照分離原理不同，可將合成膜分為濾膜和溶解-擴散膜。濾膜分離主要是根據(jù)分子量的大小來決定其是否可以通過膜孔徑，只有小于膜孔徑的分子或物質(zhì)才可以順利通過膜。而溶解-擴散膜則主要是根據(jù)溶質(zhì)分子在膜中的溶解性和擴散性進行分離。柑橘中檸檬苦素是非極性分子，呈電中性，可以溶解在液膜中，然后再通過擴散作用進入到溶液。研究顯示，在25℃時，溶解-擴散膜能將溶液中的檸檬苦素由55mg/L降到11mg/L，或從40mg/L降至8mg/L，營養(yǎng)成分的損失不超過5%[40]。與濾膜相比，溶解-擴散膜能將濃度極化現(xiàn)象降至最低，且具有很強的抗污染能力[34，41]。

　　2.6超臨界CO2脫苦

　　超臨界CO2技術(shù)脫除果酒中類檸檬苦素具有操作條件簡單、分離容易、提取速度快、活性成分和熱敏性成分不易被破壞等優(yōu)點。孟鵬等[42]優(yōu)化了金柑中檸檬苦素的超臨界CO2提取工藝參數(shù)，在萃取壓力33MPa、萃取溫度50℃、萃取時間2.2h的條件下，檸檬苦素的去除量達(dá)7.02g/kg。Patil等[43]從葡萄柚中提取檸檬苦素類化合物，確定了壓力、溫度、萃取時間、CO2流量及CO2給樣方式等最佳萃取條件，結(jié)果表明在483MPa、50℃、60min條件下，從柱頂向外注入CO2流量約為5.0L/min，檸檬苦素提取產(chǎn)量最高為6.3mg/g。但該方法需要超臨界高壓裝置、生產(chǎn)成本較高，不適合在工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)使用。

　　2.7代謝法脫苦

　　研究人員發(fā)現(xiàn)晚期采收的柑橘榨出的果汁較早期采收的甜，受這一現(xiàn)象的啟發(fā)，學(xué)者們研究了加快柑橘中苦味物質(zhì)代謝的方法[34，36]。徐仲偉等[44]選擇濃度為2000mg/L的乙烯利進行脫苦試驗，結(jié)果表明，用乙烯利處理果實5d，檸堿苦味可以降低44.9%。需要注意的是，乙烯利的濃度不能過高，否則檸堿會重新析出，且濃度控制不當(dāng)也會導(dǎo)致爛果。植物激素也影響柑橘中類檸檬苦素的含量。研究表明，吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2，4，5-三氯氧乙酸、脫落酸等生長素是諾米林合成的有效抑制劑。但是脫落酸的抑制作用能夠被細(xì)胞分裂素解除[45]，因此在果實成熟過程中可以噴灑植物激素降低果實諾米林的含量。

　　2.8基因工程脫苦

　　利用基因工程技術(shù)改良柑橘的延遲苦味性狀是一個新的突破口。通過轉(zhuǎn)基因手段引入酶基因，能夠?qū)⒏涕僦芯哂锌辔兜奈镔|(zhì)代謝為其他非苦味的物質(zhì)。

　　Kita等[46]從柑橘反照率中分離到一個能編碼檸檬酸二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(limonoidGTase，LGT)的cDNA克隆，研究了其對果實中檸檬酸苷積累的貢獻(xiàn)。結(jié)果表明，表達(dá)載體的體外轉(zhuǎn)化產(chǎn)物具有LGT活性。CitlGT作為單一拷貝基因存在于柑橘基因組中。在臍橙果實發(fā)育過程中，CitlGTmRNA對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物數(shù)量的變化與檸檬酸苷含量的變化規(guī)律相同。這表明，CitlGT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控了柑橘果實中檸檬酸苷元向葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化。

　　在柑橘生長和成熟的過程中，LARL能夠在LGT基因的催化下轉(zhuǎn)變成了無苦味的檸檬苦素類似物[47]。在未來的脫苦技術(shù)中，有望將LARL的基因?qū)敫涕倩蛑?，降解柑橘中的檸檬苦素?！?/p>

　　3小結(jié)與展望

　　柑橘果酒口感醇厚，風(fēng)味獨特，又具有濃郁的酒香和果香，深受消費者青睞，但是類檸檬苦素對產(chǎn)品的影響制約了柑橘果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。脫除柑橘酒中類檸檬苦素的方法有很多，具有較好應(yīng)用前景的方法也較多。例如添加苦味抑制劑可以較快速的掩蓋苦味;吸附法簡單易行，處理溫度低、時間短;酶法高效、快速，選擇性高;膜分離技術(shù)分離效率高、操作溫度低、處理量大，易于連續(xù)化生產(chǎn)，且由于材料化學(xué)的不斷發(fā)展，性能優(yōu)良的膜材料也相繼問世，膜分離技術(shù)必將在柑橘脫苦中具有更大的發(fā)展前景。基因工程等操作復(fù)雜，暫時無法應(yīng)用于工業(yè)化脫苦。

　　目前，在食品加工過程中優(yōu)化工藝降低苦味仍是當(dāng)下的研究熱點。隨著人們對健康要求的不斷提高，低醇發(fā)酵、低溫貯藏將成為未來柑橘果酒的發(fā)展趨勢，低醇發(fā)酵、低溫貯藏加工的果酒，不僅酒精度低，而且能更大程度地保存原果的風(fēng)味。因此優(yōu)化果酒發(fā)酵的工藝，開發(fā)營養(yǎng)、風(fēng)味及功能俱佳的柑橘低醇果酒是目前研究的重點和難點。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]李建婷，張曉丹，秦丹.我國柑橘類果酒的研究現(xiàn)狀[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016(11)：62-65.

　　[2]馬胤鵬，曾竟藍(lán)，曾璐，等.柑橘酒中苦味物質(zhì)及其脫苦技術(shù)的研究進展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017(18)：58-61.

　　[3]王松林，彭榮，崔榕，等.類檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化與脫苦研究進展[J].食品科學(xué)，2015，36(9)：279-283.

　　[4]晏敏，周宇，賀肖寒，等.柑橘籽中檸檬苦素及類似物的生物活性研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44(2)：290-296.

　　[4]袁寧，頡建明，張吉寧，等.蘭州市耕地地力評價對百合栽培適宜性研究[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2017(14)：51-53.

《柑橘果酒中的類檸檬苦素及其脫除方法綜述》

上一篇：多組學(xué)聯(lián)合分析在植物生長發(fā)育研究中的應(yīng)用

下一篇：淺談中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)模式與互聯(lián)網(wǎng)+農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢