活化α7煙堿型乙酰膽堿受體對(duì)呼吸機(jī)與大鼠的保護(hù)機(jī)制研究

　　【摘要】 目的 評(píng)價(jià)激活 α7 煙堿型乙酰膽堿受體對(duì)大鼠呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷的影響。 方法采用隨機(jī)數(shù)字法將 32 只雄性 Sprague Dawley 大鼠分為：對(duì)照組(C 組)、機(jī)械通氣組(V 組)、煙堿預(yù)處理 + 機(jī)械通氣組(N 組)、甲基牛扁堿(MLA)+ 煙堿 + 機(jī)械通氣組(MLA 組)，每組 8 只。C 組大鼠氣管插管后不進(jìn)行機(jī)械通氣，保留自主呼吸，其余各組大鼠機(jī)械通氣 2 h。N 組大鼠在機(jī)械通氣前 30 min 腹腔注射 1 mg / kg 的煙堿;MLA 組大鼠在腹腔注射煙堿前 30 min 先腹腔注射 1 mg / kg 的 MLA，其余各組大鼠腹腔注射等量等滲 NaCl 溶液。機(jī)械通氣結(jié)束后即刻處死大鼠，計(jì)算各組大鼠肺組織濕重 / 干重、蘇木素-伊紅(HE)染色、肺組織損傷病理學(xué)評(píng)分，并采用 Western-blotting 檢測(cè)白細(xì)胞介素 1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 C 組大鼠肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;V 組大鼠肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);N 組大鼠肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)稍破壞，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);MLA 組大鼠肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，肺泡萎陷，較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。4 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評(píng)分、IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F = 168.009、647.579、138.005、192.706、178.094，P 均 < 0.05)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評(píng)分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 C 組更高(P 均 < 0.05);N 組大鼠濕重 / 干重、損傷評(píng)分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評(píng)分、IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 N 組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均 < 0.05)。 結(jié)論 煙堿對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷的大鼠模型具有保護(hù)作用，其機(jī)制與激活 α7-nAChR 有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷;α7-nAChR;大鼠

　　機(jī)械通氣是急性肺損傷和急性呼吸窘迫征的重要治療手段，盡管采用了小潮氣量的通氣策略，仍會(huì)引起部分肺泡組織的過(guò)度擴(kuò)張，導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)[1-2]。VILI 的特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，以及肺組織的炎癥反應(yīng)。研究表明，VILI 大鼠模型過(guò)量表達(dá)核因子 κB、白細(xì)胞介素 6(interleukin-6， IL-6)、IL-1β 等，這些炎癥細(xì)胞因子可進(jìn)一步引起全身多器官功能障礙 [3-4]。α7 煙堿型乙酰膽堿受體(alpha7 nicotinic acetylcholine receptors，α7- nAChR)表達(dá)于巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞，迷走神經(jīng)分泌乙酰膽堿激活 α7-nAChR，來(lái)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的合成與分泌。迷走神經(jīng)分泌乙酰膽堿來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)已經(jīng)在膿毒血癥大鼠模型中被證實(shí)[5]。甲基牛扁堿(methyllycaconitine，MLA)是 α7-nAChR 特異性的阻斷劑，本研究中擬用 MLA 阻斷 α7-nAChR 來(lái)探討 α7-nAChR 在 VILI 大鼠模型中的作用，為臨床研究提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

　　選取 32 只健康清潔的雄性 Sprague Dawley 大鼠(8 ~ 12 周齡，體質(zhì)量 200 ~ 220 g)，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，以常規(guī)飼料喂養(yǎng)，實(shí)行 12 h 晝夜循環(huán)。運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字分配的方法將 32 只實(shí)驗(yàn)大鼠分為：對(duì)照組(C 組)、機(jī)械通氣組(V 組)、煙堿 + 機(jī)械通氣組(N 組)、 MLA + 煙堿 + 機(jī)械通氣組(MLA 組)，每組 8 只。

　　各組大鼠機(jī)械通氣前均禁食、禁水 12 h，腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(20 mg / kg)進(jìn)行麻醉，麻醉后備皮消毒，將 16 G 靜脈穿刺針插入大鼠氣管內(nèi)作為氣管導(dǎo)管，接動(dòng)物呼吸機(jī)(購(gòu)于南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)儀器廠)進(jìn) 行 機(jī) 械 通 氣 ，通 氣 參 數(shù) 為 ：潮 氣 量 8 ~ 10 mL / kg、通氣頻率 35 次 / min、吸呼比為 1 ∶ 1[6]。C 組大鼠氣管插管后不進(jìn)行機(jī)械通氣，保留自主呼吸，其余各組大鼠機(jī)械通氣 2 h;煙堿及 MLA 均溶于 4 mL 等滲 NaCl 溶液中，N 組大鼠在機(jī)械通氣前 30 min 腹腔注射煙堿(1 mg / kg);MLA 組大鼠在腹腔注射煙堿前 30 min 先腹腔注射 MLA(1 mg / kg); C 組、V 組大鼠在造模前均腹腔注射等滲 NaCl 溶液 4 mL。煙堿、MLA 均購(gòu)買于 Sigma 公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

　　1.2 肺組織濕重 / 干重

　　各組大鼠通氣 2 h 后用頸椎脫臼法處死，取右上肺組織稱重(濕重)，然后置于 85 ℃烤箱中 72 h，稱重(干重)，計(jì)算肺組織濕重 / 干重[7-8]。

　　1.3 肺組織蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色與損傷評(píng)分

　　取各組大鼠右中肺組織，在 4%多聚甲醛中浸泡 24 h 后用石蠟包埋，制備 5 μm 厚的切片，進(jìn)行常規(guī) HE 染色。光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行肺損傷評(píng)分，包括肺泡水腫、肺間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)充血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(無(wú)改變或非常輕微為 0 分;輕度改變?yōu)?1 分;中度改變?yōu)?2 分;重度改變?yōu)?3 分;極重度改變?yōu)?4 分)[9]。

　　1.4 Western-blotting 檢測(cè)各組大鼠肺組織 IL- 1β、IL-6 及 腫 瘤 壞 死 因 子 α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)蛋白表達(dá)水平

　　取各組大鼠右下肺組織，按常規(guī)方法加入裂解液 400 μL [50 mM NaCl，10 mM Tris，1 mM 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)， 1 mM 苯 甲 基 磺 酰 氟 化 物 (phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)，0.5 mM 釩酸鈉，50 mM 氟化鈉，1 mM 苯甲脒，1 mg / L 抑肽酶]反復(fù)研磨。30 min 后，將裂解液移至 1.5 mL 離心管中，然后在離心器下以 12 000 r / min 離心 5 min，離心半徑 5 cm，取上層清液。通過(guò)二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白分析裝置測(cè)定各樣品蛋白濃度，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS) 配平并煮沸蛋白。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠，每孔蛋白上樣量 30 μg 后電泳，再用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從 SDS-PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上，室溫下用 5%的脫脂奶粉封閉 1 h，分別加入抗鼠 IL- 1β(1 ∶ 1 000)，IL-6(1 ∶ 1 000)，TNF-α(1 ∶ 500)單克隆抗體，再加入抗兔二抗，孵育洗滌后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)這些蛋白，并用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析[10]。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

　　應(yīng)用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(x軃 ± s)表示，各組大鼠肺組織濕重 / 干重、損傷評(píng)分以及 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 蛋白表達(dá)水平比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)，以 P < 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 各組大鼠肺組織 HE 染色結(jié)果

　　C 組大鼠見(jiàn)肺泡形態(tài)和肺泡間隔距離正常，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出、出血，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);V 組大鼠見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡萎陷，肺泡內(nèi)大量滲出，透明膜形成，肺泡內(nèi)及肺泡間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);N 組大鼠肺泡形態(tài)稍破壞，肺泡間隔基本正常，肺泡內(nèi)少量滲出及出血，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);MLA 組見(jiàn)明顯肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增大，較多肺泡萎陷，肺泡內(nèi)及肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞較多，見(jiàn)圖 1。

　　2.2 各組大鼠肺組織濕重 / 干重及損傷評(píng)分

　　4 組大鼠肺組織濕重 / 干重及損傷評(píng)分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F = 168.009、647.579，P = 0.001、< 0.001)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評(píng)分均較 C 組明顯升高(P 均 < 0.05);N 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評(píng)分均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織濕重 / 干重及肺組織損傷評(píng)分均較 N 組明顯升高(P 均 < 0.05)，見(jiàn)表 1。

　　2.3 各組大鼠 IL-1β、IL-6 及 TNF-α 蛋 白 表達(dá)水平

　　4 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平 比 較 ， 差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 (F = 138.005、 192.706、178.094，P = 0.012、< 0.001、0.001)。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，V 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 C 組更高(P 均 < 0.05);N 組大鼠 IL-1β、IL-6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 V 組明顯降低(P 均 < 0.05);MLA 組大鼠肺組織 IL-1β、IL-6、 TNF-α 蛋白表達(dá)水平均較 N 組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均 < 0.05)，見(jiàn)圖 2。

　　3 討論

　　本研究通過(guò)測(cè)定各組大鼠肺組織濕重 / 干重、 HE 染色及肺組織損傷評(píng)分發(fā)現(xiàn)，V 組大鼠肺組織濕重 / 干重較 C 組更高，肺間質(zhì)廣泛水腫，肺泡腔出血，肺泡萎陷，肺組織被大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，損傷更加嚴(yán)重，進(jìn)一步提示 Sprague-Dawley 大鼠給予 8 ~ 10 mL / kg 的潮氣量可以用來(lái)構(gòu)建 VILI 的動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究;N 組大鼠肺組織濕重 / 干重較 V 組明顯減少，肺組織病理?yè)p傷明顯減輕，因此煙堿對(duì) VILI 的大鼠模型具有保護(hù)作用;V 組與 MLA 組相比，我們還發(fā)現(xiàn)如果阻斷了 α7-nAChR，煙堿的這種保護(hù)作用將消失，提示煙堿對(duì) VILI 大鼠模型的保護(hù)作用與激活 α7-nAChR 相關(guān)。

　　機(jī)械通氣可以引起廣泛的生物學(xué)應(yīng)答，包括激活促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)[11-12]。而且這些肺組織產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子和炎癥調(diào)節(jié)因子通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)人體各個(gè)器官，引起多器官功能障礙[13]。Yang 等[14]在機(jī)械通氣的 Wistar 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，機(jī)械通氣后，大鼠肺組織中 IL-1β、TNF-α 含量明顯增加。Ma 等[1]研究發(fā)現(xiàn)，給予 Sprague-Dawley 大鼠 7 mL / kg 的潮氣量后，大鼠肺組織中 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 過(guò)量表達(dá)。本研究與上述研究結(jié)果相一致。肺泡巨噬細(xì)胞在 VILI 中起關(guān)鍵作用，活化的巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子，引起肺損傷[15-17]。

　　α7-nAChR 主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，煙堿結(jié)合并激活 α7-nAChR 可以抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放 IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子。相反的，Wang 等[18]在 α7-nAChR 缺乏的野生小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，電刺激迷走神經(jīng)不能抑制 TNF 的合成，因此 α7-nAChR 在調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Ma 等[19]在胰腺炎相關(guān)肺損傷的大鼠模型中證實(shí)，尼古丁激活 α7-nAChR 后，不僅能減輕胰腺組織的水腫壞死，也能顯著減輕肺組織的病理?yè)p傷，大鼠血清中 IL-6、髓過(guò)氧化物酶、TNF-α 等炎癥因子也明顯減少。He 等[20]在腸缺血再灌注肺損傷的 SpragueDawley 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，激活 α7-nAChR 可以通過(guò)抑制 Toll 樣受體 4 / 核因子 κB 信號(hào)通路減輕腸缺血再灌注導(dǎo)致的肺組織氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)。但是 α7-nAChR 在 VILI 中的作用仍有待研究。

　　本研究證實(shí)，激活 α7-nAChR 在 VILI 大鼠模型中起保護(hù)作用，可以減輕肺組織的病理?yè)p傷，并抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。但是激活 α7-nAChR 通過(guò)何種分子信號(hào)機(jī)制來(lái)抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，仍需進(jìn)一步研究。

　　參 考 文 獻(xiàn)

　　1 Ma H, Feng X, Ding S. Hesperetin attenuates ventilator-induced acute lung injury through inhibition of NF-κB-mediated inflammation [J]. Eur J Pharmacol, 2015 (769): 333-341.

　　2 Vasques F, Duscio E, Cipulli F, et al. Determinants and prevention of ventilator-induced lung injury[J]. Crit Care Clin, 2018, 34 (3): 343-356.

　　3 Ding N, Wang F, Xiao H, et al. Mechanical ventilation enhances HMGB1 expression in an LPS-induced lung injury model[J]. PLoS One, 2013, 8 (9): e74633.

　　4 Gao W, Ju YN. Budesonide attenuates ventilator-induced lung injury in a rat model of inflammatory acute respiratory distress syndrome[J]. Arch Med Res, 2016, 47 (4): 275-284.

　　5 Pavlov VA, Ochani M, Gallowitsch-Puerta M, et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemicinflammatory response during endotoxemia[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103 (13): 5219-5223.

　　6 Kox M, Pompe J, Vaneker M, et al. The selective α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist GTS-21 attenuates ventilator-induced inflammation and lung injury[J]. Crit Care, 2009, 13 (S1): P55.

　　7 高巨，張揚(yáng)，方向志. 機(jī)械通氣預(yù)處理對(duì)大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的影響 [J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2014，34(12)： 1430-1432.

　　8 楊茂憲，施云超，朱建剛，等. 俯臥位通氣對(duì)肺內(nèi)源性急性肺損傷大鼠的影響[J/CD]. 中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志(電子版)，2016，

　　9(1)：9-13. 9 Kozian A, Schilling T, Fredén F, et al. One-lung ventilation induces hyperperfusion and alveolar damage in the ventilated lung: an experimental study [J]. Br J Anaesth, 2008, 100 (4): 549-559.

　　10 朱慶程，胡軍，范衛(wèi)民. 2 型糖尿病對(duì)骨代謝的影響及機(jī)制[J]. 江蘇醫(yī)藥，2016，42(5)：497-499.

　　11 Cressoni M, Gotti M, Chiurazzi C, et al. Mechanical power and development of ventilator-induced lung injury [J]. Anesthesiology, 2016, 124 (5): 1100-1108.

　　12 么穎，余慕明，劉艷存，等. 持續(xù)監(jiān)測(cè)和控制人工氣道氣囊壓力對(duì)機(jī)械通氣患者呼吸機(jī)相關(guān)肺炎發(fā)生率影響的 Meta 分析 [J/CD]. 中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志 (電子版)， 2016，9(6)：389-393.

　　13 Dolinay T, Kim YS, Howrylak J, et al. Inflammasomeregulated cytokines are critical mediators of acute lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2012, 185 (11): 1225-1234.

　　14 Yang SH, Lin JC, Wu SY, et al. Membrane translocation of IL-33 receptor in ventilator induced lung injury[J]. PLoS One, 2015, 10 (3): e0121391.

　　15 Silva PL, Negrini D, Rocco PR. Mechanisms of ventilator-induced lung injury in healthy lungs [J]. Best Pract Res Clin Anaesthesiol, 2015, 29 (3): 301-313.

　　16 張慧慧，蔡國(guó)龍，胡才寶，等. 烏司他丁對(duì)膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究 [J/CD]. 中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志(電子版)，2017，10(3)：153-158.

　　17 李慢中，王雅麗，李朝霞，等.蛭丹化瘀組方對(duì) LPS 誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠炎性反應(yīng)的影響[J].世界中醫(yī)藥，2016，11 (5)：876-879.

　　18 Wang H, Yu M, Ochani M, et al. Nicotinic acetylcholine receptor α7 subunit is an essential regulator of inflammation[J]. Nature, 2003, 421 (6921): 384-388.

　　19 Ma P, Yu K, Yu J, et al. Effects of nicotine and vagus nerve in severe acute pancreatitis-associated lung injury in rats[J]. Pancreas, 2016, 45 (4): 552-560.

　　20 He Y, Ye ZQ, Li X, et al. Alpha7 nicotinic acetylcholine receptor activation attenuated intestine-derived acute lung injury[J]. J Surg Res, 2016, 201 (2): 258- 265.

　　相關(guān)論文推薦：化學(xué)類專業(yè)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索與思考

《活化α7煙堿型乙酰膽堿受體對(duì)呼吸機(jī)與大鼠的保護(hù)機(jī)制研究》

上一篇：高尿酸血癥及痛風(fēng)與非酒精性脂肪性肝病的相互 關(guān)系

下一篇：間充質(zhì)干細(xì)胞臨床前安全性研究概況