間充質(zhì)干細胞臨床前安全性研究概況

　　間充質(zhì)干細胞(MSC)于 1974 年被第一次定義，而后在 20 世紀 90 年代得到推廣[1]。2006 年，細胞療法國際協(xié)會針對細胞表面陽性標志物為 MSC 建立了一個最低標準，即 CD90+ 、CD105+ 、CD73+ 、CD45– 、CD34– 、CD14– 、 CD79– 、HLA– 、DR–[2]。最初的臨床試驗中，MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖癥的研究。近年來研究表明，MSC 也具備促血管生成、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、營養(yǎng)支持等生物活性，這為其用于缺血性、炎性疾病等方面的治療提供了可能性[4]。另外 MSC 在實驗中易于獲得、可在體外大量擴增及有多系分化潛能的性質(zhì)也表明其可成為組織工程的一個強有力工具[5]。

　　1 治療機制及研究進展

　　臨床前研究表明，MSC 一般通過自身分化、營養(yǎng)支持、免疫調(diào)節(jié)等機制發(fā)揮治療作用[6]。間充質(zhì)干細胞可由一系列組織分離得到，同時在一定條件下可分化成不同的祖細胞，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞以及造血支持基質(zhì)細胞，這些細胞進一步可分化為心肌細胞、神經(jīng)細胞等。同時， MSC 可通過自分泌或旁分泌途徑釋放細胞因子，這些活性物質(zhì)可定向聚集于特定部位起到抑制細胞凋亡、纖維化，促進血管生成或緩解炎性反應等作用[7]。另外，MSC 在體內(nèi)可通過免疫調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)，借此治療一些炎性疾病。最新研究表明，干細胞可能并沒有免疫豁免的機制，其可能是通過免疫逃逸機制來實現(xiàn)相關治療作用的[8]。

　　MSC 雖然在很多領域展現(xiàn)出極大潛力，但現(xiàn)今的研究仍面臨很多挑戰(zhàn)。臨床試驗雖然正在大力進行，但數(shù)據(jù)仍較為缺乏。臨床前研究中，動物模型、干細胞來源、體外培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇目前都沒有一個明確的規(guī)定。不同來源的人源干細胞分泌的細胞因子、分化方向也有很大差異。

　　2 安全風險因素

　　由于細胞自身生物學或?qū)嶒灢僮鞯雀鞣N因素，干細胞在應用于臨床或基礎實驗的過程中存在一定安全風險，主要可分為內(nèi)源性風險、外源性風險及其他生物風險。

　　內(nèi)源性風險主要包括：①干細胞腫瘤形成相關風險。干細胞具有不斷增殖、對凋亡誘導不敏感等與腫瘤細胞相似的生長調(diào)控機制。有研究表明，胚胎干細胞(ESC)和誘導多能干細胞(iPSC)可引發(fā)良性或惡性的畸胎瘤，同時有研究表明高代次的鼠源 MSC 可自發(fā)惡性轉(zhuǎn)化。干細胞也可能影響體內(nèi)已存在的腫瘤細胞的生長和擴增，即干細胞的“促瘤性”[9]。②干細胞免疫學相關風險。實驗中需要考慮細胞的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)帶來的生物學風險。ESC 未分化前的免疫原性很低，但在分化后由于 MHC 分子的表達可表現(xiàn)出較高的免疫原性。同時體外實驗表明，ESC 和 MSC 可通過調(diào)控 T 細胞、單核細胞及 NK 細胞等的增殖分化來調(diào)節(jié)生物免疫能力。③干細胞由于自身攜帶的傳染性疾病、未知或罕見的病原體、遺傳性疾病等而產(chǎn)生的風險。外源性風險主要包括：細菌、真菌、支原體及病毒污染[10]，一般來自于實驗操作、細胞庫污染和動物基質(zhì)細胞污染等方面[11]。與內(nèi)源性風險相比，外源性風險污染途徑多，防控更為復雜。

　　另外由于干細胞的體內(nèi)歸巢和分化機制仍不明確[12]，干細胞進入機體內(nèi)可能存在非靶向部位轉(zhuǎn)移、目標以外的分化或去分化等風險。同時當大劑量的細胞被注射進入體內(nèi)，可能阻塞在注射區(qū)域，嚴重的可導致注射區(qū)域組織壞死等情況。

　　3 臨床前安全性研究概況

　　MSC 臨床前安全評價一般分為兩部分：一般毒性評價和干細胞特定安全評價。一般毒性評價包括行為觀察、臨床癥狀、血液生化測定、死亡率、組織病理檢查等。干細胞特定安全評價包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性評價和一般生物制品的評價方式相似。另外目前針對干細胞特定的安全評價也已有一定的研究，但仍缺乏專門針對干細胞評價的相關文件規(guī)范進行指導。

　　干細胞安全評價實驗設計中需考慮動物模型、給藥途徑、實驗周期等相關因素。①動物模型：考慮到異種排斥，建議選擇免疫缺陷或免疫抑制類動物，如 NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等，但也需考慮到該類動物壽命較短(12 ~ 18 個月)，且可能產(chǎn)生自發(fā)腫瘤影響實驗結果[13]。同時也有研究選擇食蟹猴、狒狒等非人靈長類動物，這類動物模型存在數(shù)據(jù)采集困難、需進行免疫抑制操作等缺點。②給藥途徑：盡量和臨床保持一致，實驗中采用的給藥途徑主要有靜脈注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③實驗周期：依據(jù)實驗目的和動物種類的不同，需制定不同的實驗周期。免疫缺陷的嚙齒類動物的實驗周期自 8 d ~ 8 個月不等，但需考慮到超過 6 個月時動物可能產(chǎn)生自發(fā)性腫瘤，影響實驗進程和結果。目前采用食蟹猴為動物模型的評價實驗主要是在一般毒性研究，實驗周期從 4 ~ 6 周不等。④細胞劑量：研究報道 MSC 輸注患者所需細胞數(shù)為(1.0 ~ 2.0)× 106 cells/kg[14]，動物實驗中則需依據(jù)不同動物種類換算得出具體的細胞劑量。

　　3.1 一般毒性

　　目前已有多項研究進行了 MSC 的一般毒性實驗。 Creane 等[15]單次肌肉注射骨髓來源 MSC 至免疫缺陷小鼠，3 個月的實驗周期內(nèi)未見實驗動物的體重、飲食、病理學等相關指征變化。Ramot 等[16]以 NOD/SCID 小鼠為模型，通過單次或 3 次肌肉注射胎盤來源 MSC 進行了為期 3 個月的毒性反應試驗，未出現(xiàn)明顯不良反應癥狀。Ra 等[17]通過單次尾靜脈注射脂肪來源 MSC 至 SCID 小鼠， 13 周內(nèi)高劑量下(2.5 × 108 cells/kg)未見明顯毒性反應。海泉等[18]以小鼠、大鼠、裸鼠為評價模型，考察人源 UC-MSC 進入動物體內(nèi)后的急性毒性反應和長期毒性反應。急性實驗中細胞劑量可達 1.25 × 108 cells/kg，長期毒性實驗中細胞量為 2.5 × 106 ~ 1 × 107 cells/kg，該實驗表明干細胞不會導致明顯毒性反應。王冠華等[19]以 ICR 小鼠為動物模型，通過單次尾靜脈給藥評價 MSC 的急性毒性反應。結果表明，MSC 無明顯的毒性反應，但在肺臟和脾臟等部位有滯留。另外也有一些研究選擇食蟹猴為動物模型，給藥周期為 4 ~ 6 周，給藥途徑為單次或多次靜脈注射、腦內(nèi)注射等[20]。一般檢測指標主要包括：行為、體重、體溫、心電圖、血細胞計數(shù)、凝血功能、血液、尿液等。

　　3.2 生物分布

　　生物分布關系到細胞在各組織臟器中的遷移、聚集、分化等情況。研究表明，干細胞移植入體內(nèi)后的遷移情況同細胞的來源、傳代次數(shù)、培養(yǎng)條件、植入方式、細胞因子及其受體相關[21]。有研究表明，MSC 移植到體內(nèi)后可聚集到特定的損傷組織通過分泌相關因子發(fā)揮作用[22]，但也有研究表明由于干細胞的大體積和表面黏附受體，大多數(shù) MSC 可阻塞在肺部形成栓塞[23]，鑒于目前對干細胞在體內(nèi)分布的情況和危害仍不清楚，進行相關研究具有重要意義。

　　目前干細胞生物分布研究主要是細胞進行體外標記后再移植入體內(nèi)，其中主要標記方式有熒光素酶[24]、綠色熒光蛋白(GFP)、增強型綠色熒光蛋白(eGFP)、近紅外染料標記[25]等。相應地出現(xiàn)了包括生物發(fā)光成像、單光子發(fā)射 CT 掃描、磁共振成像等檢測方法。同時通過 PCR、流式檢測干細胞表面標志物等方法也可以對生物分布進行動態(tài)監(jiān)測。生物發(fā)光或磁共振成像屬于活體成像技術，這項技術可減少動物使用數(shù)量和實驗解剖工作量。而在一些實驗周期較短的研究中則可采用染料(如：近紅外熒光色素等)染色的方法進行研究。

　　3.3 致瘤性

　　干細胞一般可分化成三類腫瘤：畸胎瘤、畸胎癌和繼發(fā)性腫瘤[26]。研究表明干細胞和腫瘤細胞具有很多相似的特性，例如凋亡抵抗特性、自我復制能力和相似的生長調(diào)控機制。實驗動物模型方面，由于人源干細胞在動物身上進行實驗時可能會有免疫排斥反應，所以在致瘤性實驗中通常采用免疫缺陷小鼠(如 NOD/SCID 小鼠、裸鼠等)，這類動物由于缺乏免疫系統(tǒng)往往更易產(chǎn)生自發(fā)腫瘤。聶德志等[27]將神經(jīng)干細胞和 MSC 移植入 BALB/c 裸鼠體內(nèi)進行為期 12 周的致瘤性實驗，結果顯示短期傳代后的干細胞沒有致瘤性。秦秀軍等[28]則考察了脂肪間充質(zhì)干細胞在裸鼠體內(nèi) 6 個月的致瘤性情況，也未發(fā)現(xiàn)干細胞的致瘤傾向。Ra 等[17]在 BALB/c-nu 上進行了為期 26 周的致瘤試驗，單次皮下注射 2 × 108 cells/kg 條件下試驗周期內(nèi)未見腫瘤形成。但同樣有研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射 MSC 至免疫抑制小鼠體內(nèi)，可導致肉瘤產(chǎn)生[29]。所以需要進一步的實驗數(shù)據(jù)來得到致瘤性結論。

　　4 結語

　　目前，MSC 在諸多領域都展現(xiàn)出極大的應用前景，但其安全性相關的數(shù)據(jù)和文件仍比較欠缺[30]，其生物分布、致瘤性和免疫原性等特定的安全評價試驗均有別于其他生物制品，研究中應在一般毒性實驗的基礎之上，納入細胞評價的相關安全性評價指標，力求全面完整地對間充質(zhì)干細胞的安全性進行評價。

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