一種用于早期肺癌篩查的新型自身抗體芯片

　　摘 要：非典型增生腺瘤(Atypicaladenomatoushyperplasia，AAH)和鱗狀細(xì)胞增生(squamouscelldysplasia，SCD)與肺部惡性損傷的發(fā)展有相關(guān)性，精確診斷 AAH 和SCD有助于早期確診肺癌，同時(shí)有助于肺癌高危人群的篩查與早期干預(yù)。本項(xiàng)目利用免疫反應(yīng)原理，將噬菌體展示技術(shù)與生物淘洗技術(shù)相結(jié)合，獲得可表達(dá)腫瘤相關(guān)蛋白的噬菌體特異性文庫，并將噬菌體點(diǎn)制在生物芯片上，篩選得到了與肺部損傷相關(guān)的特異性蛋白，經(jīng)測序分析鑒定出多種自身抗體為惡性腫瘤相關(guān)蛋白。最終，通過數(shù)據(jù)分析，建立篩選分類器，制成篩查檢測芯片，用于篩查 AAH 與 SCD，評估早期肺癌風(fēng)險(xiǎn)，表現(xiàn)出重要的臨床診斷應(yīng)用前景。

　　關(guān)鍵詞：肺癌;吸煙;標(biāo)志物;AAH;SCD;自身抗體

　　1 研究背景

　　肺部腫瘤是實(shí)體瘤發(fā)病率與死亡率中占比較大的病種，國家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，全國惡性腫瘤發(fā)病第1位的是肺癌，每年新發(fā)病例約78.1萬。在長期吸煙的人群中，導(dǎo)致肺癌的比例高達(dá)90%。特別是在中國，不斷上升的吸煙人群數(shù)量導(dǎo)致的肺癌發(fā)病率持續(xù)上升。近年來，在肺癌治療領(lǐng)域取得了越來越多的進(jìn)展，證實(shí)了早期發(fā)現(xiàn)對于肺癌的成功治療及生存期的延長至關(guān)重要。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，經(jīng)過手術(shù)治療的所有1A 期非小細(xì)胞肺癌患者，5年生存率大約為80%。經(jīng)過手術(shù)治療的所有ⅠB期非小細(xì)胞肺癌患者，5年生存率大約為60%。Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌，經(jīng)過手術(shù)治療的所有Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌患者，5年生存率大約為40%-50%，而ⅡA 期，Ⅲ期，Ⅳ期的生存率則逐漸降低。因此，準(zhǔn)確診斷早期惡性肺癌或早期惡性腫瘤的新技術(shù)對于提高患者生存率大有裨益。

　　非典型性腺瘤性增生(AAH)和鱗狀細(xì)胞發(fā)育不良(SCD)分別被報(bào)道為肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的前體[1，2]。Wistuba和 Gazdar之前已經(jīng)描述了由健康組織到腫瘤前病變和惡性疾病的進(jìn)展過程[3]。簡單來說，對于鱗狀細(xì)胞癌，在染色體3p21和9p21上的雜合性喪失可能導(dǎo)致端粒酶功能障礙。細(xì)胞周期調(diào)控基因的DNA 甲基化，如p16INK4a，以及FHIT和 TP53等腫瘤抑制基因中的 LOH 進(jìn)一步促進(jìn)了上皮組織細(xì)胞生長的失調(diào)，最終導(dǎo)致了原位癌和轉(zhuǎn)移性疾病。對于腺癌，主要是ras致癌基因的通路(吸煙者)或表皮生長因子受體通路(非吸煙者)基因的突變導(dǎo)致組織生長失調(diào)，最終導(dǎo)致腺癌。

　　目前應(yīng)用最廣泛的臨床檢測前腫瘤性肺 SCD 病變的方法包括：白光支氣管鏡(WLB)和自動熒光支氣管鏡(AFB)。Chen等人[4]回顧了492份論文和14項(xiàng)研究，共包含了適合進(jìn)行meta分析的15個(gè)數(shù)據(jù)集，證實(shí)了 WLB和 AFB的敏感性和特異性，且最終都經(jīng)組織學(xué)檢測進(jìn)行了驗(yàn)證。AFB的混合敏感性和特異性分別為0.90 (95% CI0.840.93)和0.56 (95% CI0.45-0.66)，而 WLB為0.66(95% CI0.58-0.73)和0.69(95% CI0.57-0.79)。因此，據(jù)報(bào)道 AFB在發(fā)現(xiàn)肺癌和腫瘤前SCD病變方面優(yōu)于 WLB，然而這項(xiàng)技術(shù)對操作人員的技術(shù)需要較高，并且需要內(nèi)窺鏡插入人體肺部進(jìn)行檢測，屬于侵入性檢測，會造成患者的不適。

　　非典型增生腺瘤出現(xiàn)在肺實(shí)質(zhì)組織周圍，主要涉及進(jìn)行氣體交換的肺泡位置。非典型增生腺瘤造成的損傷經(jīng)常是較小的、無癥狀的，射線下觀察不到的，因此常常需要使用螺旋 CT以及外科手術(shù)后的組織活檢作為診斷方式，并且該病常常會在不明確的區(qū)別點(diǎn)形成支氣管肺泡細(xì)胞癌(BAC)[5]，臨床目前根據(jù)損傷大小進(jìn)行區(qū)別，小于等于5mm 的認(rèn)為是 AAH，當(dāng)大于5mm 時(shí)定義為 BAC/腺瘤。盡管有一些成功的方法可以篩查一些肺癌的高發(fā)人群，但是僅使用螺旋 CT在區(qū)別 支 氣 管 癌、腺 癌、非典型增生腺瘤時(shí)仍然存在一定的難度，假 陽 性 率 約 為20-35%[6，7]。

　　除了這些具有侵入性的檢測方式，以血液中的生物標(biāo)志物為基礎(chǔ)的檢測方法引起了廣大科研工作者的興趣，檢測與腫瘤相關(guān)抗原的血清抗體(TAAs)可以為早期癌癥提供更可靠的診斷信息[8，9]。免疫系統(tǒng)的敏感性極高，可以檢測到人體中少量腫瘤細(xì)胞通過大量激活 T 細(xì)胞而產(chǎn)生的 TAAs。據(jù)報(bào)道，自身抗體p53可在早期卵巢癌和結(jié)直腸癌患者體內(nèi)檢測到[10]，另外，應(yīng)用血清自身抗體組合可以比放射檢測法早5年檢測發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[11]。30%的導(dǎo)管原位癌患者可以檢測到原癌基因 HER-2/neu被過度表達(dá)的相應(yīng)血清抗體[12]。因此，根據(jù)身體免疫系統(tǒng)這種自然的抗體倍增效應(yīng)原理，通過檢測抗體來檢測病變前肺癌的方案是合乎邏 輯 的，也是切實(shí)可行的。本研究就是利用血清中存在的損傷特異性抗體來檢 測AAH 和SCD肺損傷。這種方法是一種有效的、非侵入性的評價(jià)肺癌風(fēng)險(xiǎn)的方案。

　　2 方法與材料

　　2.1 研究人群

　　2012年-2016年間就診于河北大學(xué)附屬醫(yī)院的1500例高?；颊?年齡大于55周歲，每年吸煙大于25包)，患者血清取自治療前，之后行支氣管內(nèi)窺鏡及低劑量螺旋 CT 檢測，并對不規(guī)則組織或者可疑組織進(jìn)行活檢，對于確診 SCD 或者 AAH 的樣本納入本項(xiàng)研究，并從六個(gè)患者肺部取下三份SCD組織，三份 AAH 組織構(gòu)建cDNA 文庫。另外，收集600份血清，其中150份 AAH，150份SCD，300份正常對照樣本。采用靜脈采血的方法使用紅色蓋的采血管抽血，血液靜置30min后，離心分離血清，分裝后-80℃保存。表1列出血清的詳細(xì)信息。

　　2.2 RNA提取及T7噬菌體構(gòu)建

　　使用上述提到的組織分別構(gòu)建 AAH 和 SCD 的 噬 菌 體 文 庫。使 用 RNeasy MiniKit(Qiagen).試劑盒提取總 RNA，使用 OligotexDirectmRNA MiniKit(Qiagen)分離 mRNA，并測定 mRNA 濃度，調(diào)整濃度一致后，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入2μLDirectionalEcoRI/HindIIILinker，在 T4DNA 連接酶的作用下16℃連接過夜。之后，分別加入 EcoRI和 HindIII各100U，37℃溫育2h消化接頭，得到兩端分別有 EcoRI和 HindIII粘性末端的雙鏈cD-NA。之后，連接進(jìn) T7噬菌體，通過噬菌斑測定，確定文庫的滴度。

　　生物淘洗使用 AAH/SCD 及正常血清樣本，為了去除非腫瘤相關(guān)蛋白，先使用正常血清與封閉的 G 蛋白珠反應(yīng)，非特異性的噬菌體將結(jié)合在蛋白珠上，未結(jié)合的噬菌體再與 AAH 和SCD血清反應(yīng)，之后將結(jié)合的噬菌體洗脫并富集，反復(fù)淘洗四次，獲得 AAH/SCD 特異性噬菌體文庫。反應(yīng)的步驟按照 Novagen公司 T7SelectBiopanningKit說明書進(jìn)行。四次淘洗之后的噬菌體感染細(xì)菌并在固體培養(yǎng)基上測定滴度。之后選擇并確定合適的稀釋度，以獲得單克隆的噬菌斑，測試結(jié)果是稀釋107-108時(shí)可以看到單克隆的噬菌斑。

　　為了確定生物淘洗富集的噬菌體的程度，將四次淘洗的結(jié)果分別在瓊脂板上培養(yǎng)，形成1-4號培養(yǎng)板，并將板上的噬菌體轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，將 AAH/SCD患者血清與膜進(jìn)行免疫反應(yīng)，血 清 按1∶2000稀 釋，之 后 加 HRP-標(biāo) 記 的 二 抗，二 抗 以1∶1000稀 釋，之 后 使 用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，從 BP1到 BP4反應(yīng)活性噬菌體的量逐漸增加。另外，為了確定噬菌體的特異性，在 BP4上轉(zhuǎn)印兩張相同的硝酸纖維素膜，分別與 AHH/SCD 和正常人血清反應(yīng)，之后加 HRP標(biāo)記的二抗，用 ECL化學(xué)發(fā)光法觀察結(jié)果。

　　2.3 高通量芯片篩選

　　通過四輪的生物淘洗，獲得了4000個(gè)獨(dú)立的噬菌體克隆，分別在96孔板上培養(yǎng)富集。每孔加入150μLE.coliBLT5615細(xì)胞，37℃ 培養(yǎng)3h，培養(yǎng)之后，取30μL上清轉(zhuǎn)入384孔板，空噬菌體 T7文庫也分別加到384孔板中，作為內(nèi)對照。之后使用 Gesim 公司的 NP2.1型點(diǎn)樣儀進(jìn)行芯片的點(diǎn)制。

　　使用5份 AAH 和5份SCD 血清進(jìn)行芯片反應(yīng)，(以上10份樣本應(yīng)該為非制作噬菌體文庫的血清樣本)，兔抗 T7噬菌體的二抗用來作為內(nèi)對照，血清用細(xì)菌培養(yǎng)基30倍稀釋，T7抗體1∶3000稀釋(用 TBST稀釋)，室溫反應(yīng)1h，芯片沖洗后，與Cy-5標(biāo)記的抗人抗體和Cy3標(biāo)記的抗兔抗體反應(yīng)，二抗分別稀釋4000倍，室溫反應(yīng)1h，之后用 GenePix4000B掃描儀掃描，并用 GenePix5.0分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析，并對Cy5∶Cy3的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，對于比值高于兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的蛋白可以做為候選蛋白。

　　2.3 用診斷芯片進(jìn)行血清樣本檢測

　　將400個(gè)篩選出的噬菌體克隆以及200個(gè)空噬菌體分別進(jìn)行富集，之后點(diǎn)制在芯片上，制成診斷用芯片。使用50例 AAH，50例SCD 以及100對照，組成訓(xùn)練集，按上述方法進(jìn)行檢測，通過算法，獲得分類器，之后再選擇400份血清對分類器進(jìn)行驗(yàn)證，包括100份 AAH，100份SCD，200份對照，檢測后分別用 AAH 和SCD的分類器進(jìn)行評估。最終結(jié)果與實(shí)際樣本信息進(jìn)行對比，統(tǒng)計(jì)敏感性與特異性。

　　2.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)模型構(gòu)建

　　用 Cy5中位數(shù)與 Cy3中位數(shù)的比值作為血清中噬菌體蛋白的表達(dá)值，為了平衡芯片間的差異，根據(jù)公式[(噬菌體蛋白 Cy5/Cy3)-(空 T7Cy5/Cy3)]/(空 T7Cy5/Cy3)對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。歸一化之后的 Cy5：Cy3值作為每一個(gè)噬菌體克隆的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，之 后 將AAH 樣本和SCD樣本，正常樣本的數(shù)據(jù)在JMP統(tǒng)計(jì)軟件上進(jìn)行t-檢驗(yàn)，選擇 P值<0.01的蛋白做為候選標(biāo)志物，并歸集成不同的分類器。為了獲得更準(zhǔn)確的分類器模型，又使用 SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行了 LR 邏輯回歸分析，對模型中的蛋白分別進(jìn)行了權(quán)重計(jì)算，并且建立了 ROC曲線，形成一種最佳的疾病診斷模型。

　　2.5 測序鑒定

　　對于分類器篩選出的噬菌體的測序鑒定，使用的是商業(yè)化的噬菌體通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，上 游 引 物：5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′，下 游 引 物：5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′。PCR產(chǎn)物純化后測序，測序結(jié)果在 GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST比對。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 生物淘選噬菌體文庫使用 AAH 或者SCD患者的組織進(jìn)行 T7噬菌體文庫的構(gòu)建，測定文庫滴度，AAH 文庫5.5×106，SCD 文 庫3.8×106。經(jīng) 過 PCR 檢 測，結(jié)果顯示噬菌體中插入的片段約為0.5-2kb，證明文庫構(gòu)建成功。

　　將以上兩個(gè)文庫混合，使用 AAH/SCD 及正常血清樣本進(jìn)行生物淘洗，篩選在噬菌體上表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，使用患者血清作為基礎(chǔ)抗體來源，免疫檢測顯示，反復(fù)多次的淘洗和噬菌體擴(kuò)增，可以獲得更大量的免疫反應(yīng)噬菌體(圖1)。以上免疫反應(yīng)表明了噬菌體表面表達(dá)蛋白與病人血清中抗體的高親和力。同時(shí)，相比之下，某些克隆與正常血清并未發(fā)生免疫反應(yīng)，即這些克隆為病人特異性相關(guān)克隆，而正常血清也反應(yīng)的克隆即為表達(dá)非特異蛋白的背景性噬菌體克隆。

　　圖1中，為了確定生物淘洗的富集效果，淘洗結(jié)果展示在 LB培養(yǎng)基上，其中 BP4顯示了比BP3更多的免疫反應(yīng)性。舉例說明了使用患者的血清連續(xù)富集可獲得腫瘤相關(guān)抗體。為了驗(yàn)證富集的蛋白的特異性，用兩個(gè)硝酸纖維素膜在 BP4的培養(yǎng)基上印一下，一個(gè)用 AAH/SCD血清反應(yīng)，另一個(gè)用正常血清反應(yīng)。多個(gè)免疫反應(yīng)克隆在疾病組顯示免疫特性，而正常組無反應(yīng)。

　　3.2 高通量篩選

　　從 BP4的噬菌體文庫中隨機(jī)篩選出4000個(gè)噬菌體并點(diǎn)制在附有薄膜涂層的微陣列芯片上，之后用5個(gè)單獨(dú)的 AAH 或 SCD 患者 血 清(非生物淘洗用樣本)樣本與芯片反應(yīng)。根 據(jù)Cy5∶Cy3信號篩選出了238個(gè) AAH 相關(guān)噬菌體，193個(gè)SCD相關(guān)噬菌體。再次篩選信號比大于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的噬菌體，作為診斷芯片構(gòu)建的候選噬菌體。圖2展示了 Cy5∶Cy3線性回歸的結(jié)果。

　　噬菌體克隆點(diǎn)制在芯片上，檢測患者血清樣本，圖2展示了部分 AAH 和 SCD 患者樣本的芯片圖，以及芯片掃描的熒光值對應(yīng)的散點(diǎn)圖。

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　　3.3 統(tǒng)計(jì)分析

　　通過高通量篩選，再次挑選出來400個(gè)免疫活性噬菌體，加上200空T7噬菌體，一起點(diǎn)制在芯片上制成診斷用芯片。點(diǎn)制多張芯片，分別用于評估50個(gè) AAH 和50個(gè)SCD，以及100個(gè)對照正常血清樣本，形成一個(gè)訓(xùn)練集。分別進(jìn)行歸一化，并統(tǒng)計(jì)400個(gè)噬菌體在正常血清和疾病血 清 中 的 Cy5∶Cy3比 值。通 過 T 檢驗(yàn)獲得每個(gè)蛋白的cut-off值。經(jīng) 過 檢 測，47 例AAH，39例SCD超過設(shè)定的cut-off值。

　　根據(jù)P值，收集前30個(gè)噬菌體克隆，進(jìn)行組合，然后使用邏輯分析，選最優(yōu)敏感性的回歸算法，區(qū)分病人和正常人。通過測試，結(jié)果使用9種噬菌體，對于 AAH 最高預(yù)測敏感性可達(dá)92.3%，特異性90.2%。使用LOOCV(leave-one-outcross-validation)算法這些結(jié)果得到進(jìn)一步驗(yàn)證，ROC曲線得到 AUC=0.874。因此，9個(gè)噬菌體蛋白質(zhì)的組合在 AAH 中顯示出最精確、穩(wěn)定的分類效果。同樣的方法在對SCD測試時(shí)表現(xiàn)出更好的效果，敏感性98.3%、特異性95.6%，同樣使用 LOOCV 算法驗(yàn)證，ROC曲線得到 AUC=0.959。最終使用13種噬菌體的組合在SCD中顯示出最精確、穩(wěn)定的分類效果。

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