植物種子中氨基酸成分測定方法的比較分析

　　摘 要 氨基酸以游離態(tài)或在肽和蛋白質(zhì)中的線性鏈形式存在，在蛋白質(zhì)中，有20 種常見氨基酸，因此，氨基酸分析在蛋白質(zhì)、食品和飼料成分的研究中具有重要作用?‍‌‍?‍‌‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌??‍?‍?‍‌‍?‍?‍?‍‌‍‌‍‌‍‌‍?‍‌‍?‍???‍?‍?‍?‍?‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍‌‍‌‍‌‍?。隨著氨基酸成分分析需求越來越高，從越來越少的蛋白質(zhì)和肽中獲取序列信息的能力給氨基酸分析技術(shù)帶來了巨大的壓力。文章在現(xiàn)階段氨基酸成分測定法的綜述基礎(chǔ)上，對植物種子的氨基酸成分測定方法，從使用方法和測定效果兩個(gè)方面進(jìn)行了比較，以期為相關(guān)從業(yè)人員的實(shí)踐提供參考。

　　關(guān)鍵詞 植物種子；成分分析；氨基酸測定；方法比較

　　植物是生態(tài)環(huán)境中十分重要的組成部分，也是人類重要的食物和營養(yǎng)來源。特別是在植物種子中，富含大量的氨基酸1-α、氨基-γ-（胍基氧基）、正丁酸及其他游離氨基酸，十分有益于人體健康，例如，1-瓜氨酸是非必需氨基酸卻時(shí)常參與器官間代謝，它也參與一氧化氮信號分子的產(chǎn)生，并且是有效的血管擴(kuò)張劑。有鑒于此，對植物種子中的游離氨基酸進(jìn)行分析對于確定植物種子的質(zhì)量等非常重要[1]。由于氨基酸成分的測定方法很多，在實(shí)踐中研究人員很難選擇出恰當(dāng)?shù)臏y定方法，以保障植物種子的氨基酸測定在較大的線性范圍內(nèi)，確保植物種子氨基酸成分測定的精度、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。因此，迫切需要針對現(xiàn)階段常用的氨基酸測定方法加以比較。

　　1 氨基酸成分測定方法

　　現(xiàn)代氨基酸成分分析測定方法有很多，例如，毛細(xì)管電泳、氣相色譜、qNMR和液相色譜等氨基酸成分測定方法[2]。用于氨基酸衍生化的試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）、9-芴基甲基-氯甲酸酯（FMOC-Cl）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯（DNS）和鄰苯二甲醛（OPA）。由于酸性、堿性和中性行為及其關(guān)鍵對的存在，氨基酸的分離具有挑戰(zhàn)性。關(guān)鍵對緊密洗脫氨基酸衍生物，例如甘氨酸、β-丙氨酸和蛋氨酸。通過RP-HPLC使用熒光（FLD）、紫外線和二極管陣列檢測器（DAD）進(jìn)行氨基酸測定，通常在柱前衍生化后進(jìn)行。但是，這些氨基酸成分測定方法或多或少都有弊端。例如，茚三酮雖然是最通用的檢測方法，但當(dāng)需要定量低于100 皮摩爾的氨基酸時(shí)，其有效性會下降；鄰苯二甲醛盡管具有出色的靈敏度，但亞胺酸定量分析效果較差；PTC化學(xué)試劑提供了一種可行的替代方法，但是與樣品相關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)會導(dǎo)致谷氨酸和天冬氨酸的回收率可變。

　　分析氨基酸純度，同樣有許多方法。例如，針對校準(zhǔn)物雜質(zhì)的紫外線檢測的高效液相色譜法（HPLC-UV/Vis）或具有火焰離子化檢測的氣相色譜法（GC-FID）等[3]。但是，這些方法通常會遭受非色譜分離的困擾，導(dǎo)致與雜質(zhì)相關(guān)的巨大不確定性，使得雜質(zhì)無法得到充分校準(zhǔn)，必須再次進(jìn)行來源或合成然后表征。因此，需要進(jìn)一步開發(fā)用于氨基酸成分測定的方法。通過IEC結(jié)合茚三酮進(jìn)行柱后衍生化測定氨基酸的方法，研究人員研制了全自動儀器，例如，日立L-8800分析儀和日立L-8900 分析儀等，使這種分析在常規(guī)基礎(chǔ)上可行，將氨基酸測定提升到新的高度，并應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究中。此外，將氣相色譜儀與同位素比值質(zhì)譜儀（IRMS）儀器（GC-C-IRMS）連接起來的燃燒接口的概念，允許使用單個(gè)加標(biāo)化合物對多種有機(jī)物進(jìn)行柱后IDMS分析，來確定同位素標(biāo)記尖峰的質(zhì)量流，并且可以在25℃下快速進(jìn)行[4]。

　　2 氨基酸成分測定方法的比較

　　2.1 使用方法的比較

　　使用C 8色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD進(jìn)行氨基酸成分測定需要使用到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、三水合乙酸鈉、鹽酸、2-巰基乙醇、HPLC級甲醇、乙腈、β-丙氨酸和OPA、1-鳥氨酸、冰醋酸、Brij-35、硼酸鈉、HPLC級水。首先將50 mg OPA溶于1.25 mL HPLC級甲醇中，然后將11.1 mL 40mmol/L硼酸鈉，0.5 mL 3.1％Brij-35 和50 μL 2-巰基乙醇（ME）溶解。

　　使用HPLC系統(tǒng)分離氨基酸。通過由Instant Pilot型號G4208 A控制的1260Infinity熒光檢測器進(jìn)行檢測[5]。該系統(tǒng)對PE Nelson 900 接口和PE Nelson 600 鏈接盒進(jìn)行了調(diào)整。流動相由（A）20 mmol/L乙酸鈉緩沖液和（B）乙腈/甲醇/水（50 /32 /18）組成。通過以下梯度程序?qū)崿F(xiàn)了28 分鐘的氨基酸分離：等度20％ B，持續(xù)4分鐘，在2分鐘內(nèi)從20％B逐漸增加到32％ B，4分鐘內(nèi)從32％～34％ B逐漸增加，然后增加3分鐘，從34％ B增至38％B，然后在9 分鐘內(nèi)線性增加至95％ B，保持等度5％ B 2 分鐘，然后在1分鐘內(nèi)恢復(fù)到初始狀態(tài)20％ B并保持等度4 分鐘。流速為0.6 mL / min，進(jìn)樣量為5μL。衍生化過程是自動化的；在進(jìn)樣之前，將100 μL OPA的等分試樣用自動進(jìn)樣器吸收，并添加到含有果汁樣品或氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC小瓶中。將OPA樣品混合物在25±1 ℃下孵育2 分鐘。然后立即通過HPLC-FLD分析反應(yīng)混合物。為了檢測氨基酸，將熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射分別設(shè)置在340 nm和455 nm。

　　使用NHS-醋酸鹽和DEPC進(jìn)行氨基酸測定需要使用到NHS-醋酸鹽、DEPC、咪唑、用于MS的所有溶劑和添加劑（HPLC級）。將15 mmol/L NHS乙酸酯溶于33％（體積比）乙腈（ACN）中，并用水按1:10 稀釋。將PBS中的50 pmol ADH或PK與0.1%的NHS-乙酸鹽混合，最終體積為20 μL，并在23 ℃下孵育15 分鐘。隨后，添加NuPAGE LDS樣品緩沖液和還原劑，并使用NuPAGEBis-Tris凝膠進(jìn)行凝膠電泳。用NHS-乙酸酯標(biāo)記的蛋白質(zhì)在凝膠中水解。為此，從凝膠上切下蛋白條帶，然后用10 mmol/L二硫蘇糖醇還原蛋白，用55mmol/L碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶（Roche）水解。用水將DEPC稀釋至0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、2.5 mmol/L和5mmol/L。將HEPES中的50 pmol ADH或PK與0、2、10、50 和100 摩爾過量的DEPC混合，并在37 ℃和500 rpm下孵育1分鐘。通過在冰上添加1μL 10 mmol/L咪唑來終止標(biāo)記反應(yīng)。隨后，將蛋白質(zhì)以3體積沉淀。100％（體積比）冰冷的乙醇和1/10 體積0.5 mol/L乙酸鈉pH 5.3，然后在-20℃下孵育2小時(shí)。離心分離蛋白質(zhì)，并用80％（體積比）乙醇洗滌沉淀，并在真空離心機(jī)中干燥。將通過凝膠水解或溶液水解獲得的肽溶解在2％（體積比）ACN / 0.1％（體積比）FA中，并加載到反相C18 預(yù)柱濃縮肽。使用0.1％ FA（體積比）作為流動相A，使用80％（體積比）ACN / 0.1％（體積比）FA作為流動相B，然后在反相C18分析柱上分離多肽，在70 分鐘內(nèi)以300/min的流速以90％乙醇的梯度洗脫。將這些肽直接洗脫到Q Exactive Plus混合四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀中，并以數(shù)據(jù)依賴模式進(jìn)行分析?‍‌‍?‍‌‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍?‍‌‍?‍‌??‍?‍?‍‌‍?‍?‍?‍‌‍‌‍‌‍‌‍?‍‌‍?‍???‍?‍?‍?‍?‍?‍?‍‌‍?‍‌‍?‍‌‍‌‍‌‍?。

　　2.2 測定結(jié)果的比較

　　使用C8色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD進(jìn)行氨基酸成分測定將儲備溶液進(jìn)一步稀釋以制成最終濃度為2.5μg/mL的溶液。然后將最終濃度依次稀釋為0.08μg/ mL、0.16μg/ mL、0.32μg/ mL、0.64μg/ mL、1.28μg/ mL，用于校準(zhǔn)曲線。通過注入5μL連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液評估不同氨基酸的校準(zhǔn)曲線的線性。通過繪制HPLC峰面積相對于其濃度的曲線來獲得校準(zhǔn)圖。分別以3和10的信噪比（S / N）確定檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。通過標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合物和樣品的重復(fù)性和中間精度評估優(yōu)化該方法的精度。該方法的可重復(fù)性通過連續(xù)3天每天從預(yù)定的連續(xù)進(jìn)樣（n = 5）中獲得的單個(gè)峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（％RSD）進(jìn)行評估。

　　使用NHS-醋酸鹽和DEPC進(jìn)行氨基酸測定，在評估標(biāo)記氨基酸的反應(yīng)性時(shí)，幾乎所有的氨基酸都被NHS-乙酸鹽和DEPC標(biāo)記，這表明氨基酸的反應(yīng)性很高。從技術(shù)角度來看，NHS-乙酸酯標(biāo)記的可重復(fù)性高于觀察到的DEPC標(biāo)記。相較于以前的結(jié)果，在評估賴氨酸殘基的標(biāo)記百分比時(shí)，似乎經(jīng)常在NHS標(biāo)記中觀察到較高的標(biāo)記百分比；對于少量氨基酸，使用DEPC時(shí)觀察到更高的標(biāo)記百分比。通過儀器徹底轉(zhuǎn)移纈氨酸的進(jìn)一步檢查，將使用與色譜柱后IDMS相同的色譜法（但不添加峰）的纈氨酸的碳同位素增量與離線獲得的相同同位素增量進(jìn)行比較。如果這兩個(gè)同位素δ值之間存在顯著差異，則纈氨酸中的少量雜質(zhì)具有高度異常的同位素δ值，或者在色譜分離過程中存在纈氨酸的分餾現(xiàn)象。

　　3 結(jié)論

　　植物種子的氨基酸成分測定，關(guān)鍵在于衍生試劑的選擇。選擇衍生試劑的標(biāo)準(zhǔn)是能與各氨基酸定量反應(yīng)，每種氨基酸只生成一種化合物且產(chǎn)物有一定的穩(wěn)定性，不產(chǎn)生或易于排除干擾物；操作簡單，色譜分離分辨率高，檢測靈敏度高，分析時(shí)間短，便于實(shí)現(xiàn)自動化和使產(chǎn)物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。當(dāng)然，不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脫時(shí)間和順序也不盡相同。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1]王文特,吳鴻敏,傅駿青,等.特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品滲透壓的不同檢測方法和結(jié)果比較分析[J].現(xiàn)代食品科技,2020,36(9):300-308,187.

　　[2]彭波,黃新華,何璐璐,等.信陽地區(qū)特種稻種子氨基酸含量的檢測分析[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,33(1):46-53.

　　[3]彭振英,單雷,張智猛,等.花生遠(yuǎn)緣雜交后代的氨基酸含量變異分析[J].花生學(xué)報(bào),2019,48(1):21-26.

　　作者董玉迪 張 曼 田 娟 孫墨可 郭來春

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