食源性人獸共患病病原活菌檢測技術(shù)研究進展

　　摘　要 ：食源性人獸共患病已成為威脅人類健康、食品安全和畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素，因此發(fā)展快速、準(zhǔn)確、高效的人獸共患病病原活菌檢測技術(shù)非常必要。目前已有多種針對活菌的檢測方法。本文比較分析了目前正在使用或開發(fā)的人獸共患病病原活菌檢測技術(shù)。同時，利用 PMA-qPCR 檢測技術(shù)，進行了副溶血性弧菌檢測效果驗證，認為該檢測技術(shù)兼具檢測速度快、靈敏度高、特異性強、成本低等優(yōu)點，作為一種新型的活菌快速檢測技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。另外，一種新型的鉑化合物檢測技術(shù)也被證明可用于活菌檢測。

　　關(guān)鍵詞 ：食源性人獸共患病 ;病原 ;活菌 ;檢測技術(shù)

　　世界動物衛(wèi)生組織(OIE)定義的食源性人獸共患病是指通過食物在動物與人之間傳播的感染和疾病。2016 年世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的一份報告稱，每年至少有 6 億人，即全球 1/10 人口，因污染食物而患病，其中 42 萬人死亡，多為兒童、青少年;盡管 5 歲以下兒童僅占全球人口的 9%，但他們卻占食源性疾病死亡人數(shù)的 30% 左右 [1-2] 。食源性細菌是食源性人獸共患病的主要病原，主要宿主是動物，其引發(fā)的重大動物傳染病嚴(yán)重影響了動物源性食品安全與獸醫(yī)公共衛(wèi)生，因此如何快速檢測病原對保障畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康具有十分重要的意義?；罴毦鷵碛卸玖爸虏⌒?，可對機體造成傷害，所以檢測病原菌的關(guān)鍵是區(qū)分活死菌以及致病和非致病菌 [3] 。對活菌的判定指標(biāo)主要為：是否可培養(yǎng)，是否能新陳代謝從而形成產(chǎn)物，是否有完整的細胞膜。以下針對食源性人獸共患病的活菌檢測技術(shù)進行概括，并選擇實用性較強的 PMA-qPCR 檢測方法進行驗證。

　　1　活菌培養(yǎng)檢測技術(shù)

　　培養(yǎng)法是指在人為控制條件下，為特定微生物創(chuàng)造適宜的生長繁殖條件，從而達到特異性分離某種微生物的方法，被廣泛應(yīng)用于食品中的病原菌檢測，是目前使用最廣泛，也是最經(jīng)典的一種檢測手段?，F(xiàn)行食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中的細菌檢測大多采用培養(yǎng)法，如沙門氏菌(GB 4789.4)、單增李斯特氏桿菌(GB 4789.30)、溶血性鏈球菌(GB 4789.11)、副溶血性弧菌(GB 4789.7)等的檢測。培養(yǎng)法主要包括增菌、選擇性培養(yǎng)分離、生化鑒定等步驟，具有檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。培養(yǎng)法以得到活菌樣本為判定依據(jù)，具有極高的可信度，這也是其被廣泛應(yīng)用于食源性人獸共患病病原檢測的重要原因。

　　然而，培養(yǎng)法周期長，一般要 4~5 d，有的甚者達到 7 d ;而且過程繁瑣，對檢測人員要求較高，檢測結(jié)果受人為因素影響大，在挑選可疑菌落環(huán)節(jié)易造成檢測結(jié)果不一致，甚者造成假陰性。周期長、過程繁瑣的檢測技術(shù)已經(jīng)不適用于當(dāng)前的社會發(fā)展形勢，不僅阻滯了食品流通，也會影響食品品質(zhì)，從而造成巨大經(jīng)濟損失。此外，培養(yǎng)法的檢測范圍有限，在低濃度水平下，對許多微生物的分離和鑒定都很困難 [3] 。某些細菌，如大腸桿菌、李斯特菌、綠膿桿菌等，可能會進入到一個“活的但不可培養(yǎng)” (VBNC)狀態(tài)，這種情況下更無法進行細菌培養(yǎng)。

　　2　活菌新陳代謝產(chǎn)物檢測技術(shù)

　　2.1 免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)

　　免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)設(shè)計的活菌檢測方法。該方法是檢測機體產(chǎn)生的抗原、抗體、免疫細胞、細胞因子等。林賽君 [4] 利用酶聯(lián)免疫 MINI-VIDAS 法，檢測單核增生李斯特菌的準(zhǔn)確度為 99.6%，高于國標(biāo)法的 99.2%。免疫學(xué)技術(shù)具有敏感性強、準(zhǔn)確性高、檢測速度快等優(yōu)點。但其假陽性率高，不能準(zhǔn)確進行活菌定量檢測;單克隆抗體的制備較困難，容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，存在抗體與非抗原物質(zhì)之間的非特異性反應(yīng);靈敏度較低，需要經(jīng)過必需的富集步驟。因此，在實際操作中，免疫學(xué)活菌檢測技術(shù)常常和其他技術(shù)聯(lián)合使用。

　　2.2 mRNA 法

　　該方法利用逆轉(zhuǎn)錄酶對提取的 RNA 進行逆轉(zhuǎn)錄 PCR，其原理是利用細菌轉(zhuǎn)錄物對胞內(nèi)和胞外 RNase 降解敏感。mRNA 水平在細胞死亡后快速下降，所以 mRNA 只存在于活細胞內(nèi)，如大腸桿菌 O157:H7 的 RT-PCR 測定 [5] 。但該方法存在一定缺陷：首先在逆轉(zhuǎn)錄 PCR 過程中，由于 mRNA 殘留的存在，會污染大量死亡細菌(104 ~107 個 /mL)，從而產(chǎn)生假陽性結(jié)果;其次細胞中的 RNA 豐度和穩(wěn)定性不均一，并且存在一些 RNA 分子，其在喪失活力后也可以在細胞中持續(xù)存在較長時間;最后 RNA 容易降解，處理 RNA 需要的技術(shù)含量偏高。因此，該方法不太符合快速、簡便檢測的要求，僅適合于科研領(lǐng)域。

　　2.3　ATP 生物發(fā)光法

　　ATP 是活細胞中含量相對穩(wěn)定的一種代謝物，其生物半衰期較短，當(dāng)細菌生長抑制或死亡后，菌體細胞內(nèi)的 ATP 含量會明顯下降或消失，因此 ATP 依賴性的熒火蟲發(fā)光素酶(Firefly luoiferase)催化熒火蟲發(fā)光素(Firefly luciferin)氧化發(fā)光反應(yīng)可作為活菌的檢測標(biāo)志。利用反應(yīng)發(fā)光強度和 ATP 呈正比的特性，可以得出樣品中的細菌數(shù)目。雖然該方法需要的試劑和實驗器材簡單并且檢測快速，但靈敏度較低，測定極限為 1×10-13 mol，約 1×104 CFU 活菌數(shù) [6] 。同時，ATP 生物發(fā)光法不能區(qū)分微生物 ATP 與非微生物 ATP，并且樣品本身、ATP 提取劑等含有離子。這些離子又會對 ATP 的測定造成干擾，抑制發(fā)光。因此，生物發(fā)光法只局限于總細菌數(shù)量的檢測，不能用于區(qū)分致病菌與非致病菌，這在很大程度上限制了生物發(fā)光法的普及應(yīng)用。

　　2.4　指示劑法

　　細菌在代謝過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物能夠還原一些指示劑并使之變色，因而可通過顏色變化來判定待檢樣品中的細菌活性。該方法常用的指示劑主要有 CTC、INT 和刃天青鹽。無菌時指示劑顏色為母液顏色，而當(dāng)有菌落時，指示液會被還原成紅色或者粉紅。Schaule 等 [7] 將 CTC 偶聯(lián)熒光顯微鏡技術(shù)應(yīng)用于飲水和生物膜中活菌的檢測，證明該偶聯(lián)技術(shù)可對活菌進行定量檢測。但是該方法使用的指示劑無法對細菌進行特異性染色，而且 CTC 存在一定的毒性，從而影響細菌的生長代謝。

　　2.5 生物傳感器

　　生物傳感器是對生物物質(zhì)敏感并能將其濃度轉(zhuǎn)換為電信號的檢測儀器。Nanduri 等 [8] 應(yīng)用生物傳感器檢測單核細胞增生李斯菌，檢測限為 2×106 CFU/mL。生物傳感器具有穩(wěn)定性好、選擇性強、靈敏度高、成本低等優(yōu)點，能在復(fù)雜體系中進行快速連續(xù)檢測。不同類型的生物傳感器具有各自獨特的優(yōu)點，但又存在各自的局限性。生物傳感器本身不能鑒定菌種，常常需要和其他的檢測方法聯(lián)合使用，為此基于免疫原理的生物傳感器成為當(dāng)前的研究熱點。

　　2.6 噬菌體識別檢測技術(shù)

　　噬菌體是一種能夠侵入細菌并在宿主細菌體內(nèi)進行增殖的病毒，具有拮抗細菌、裂解細菌的特性。噬菌體檢測技術(shù)的原理是利用噬菌體表達外源基因，將待選的基因片段定向插入噬菌體衣殼蛋白基因，通過親和富集法，篩選特異的蛋白質(zhì)或多肽的噬菌體，從而識別生物毒素、細菌、孢子和病毒的抗體等。基于噬菌體開發(fā)的檢測技術(shù)具有能區(qū)分活死菌的優(yōu)點。Favrin 等 [9] 將該免疫磁性分離噬菌體擴增法用于肉湯中腸道沙門氏菌的檢測，發(fā)現(xiàn)檢出限達 104 CFU/mL。但由于噬菌體的一般宿主譜較窄，往往只對細菌某種血清型或分離株有特異性。

　　3　細胞膜完整性檢測技術(shù)

　　3.1 流式細胞術(shù)

　　流式細胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)是在流式細胞儀基礎(chǔ)上，對處于快速直線流動狀態(tài)，且逐個通過光束的單個細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段。該技術(shù)能高速分析上萬個細胞，并能同時測量細胞的物理或化學(xué)性質(zhì)。李影等 [10] 將流式細胞儀和熒光染色相聯(lián)合，對大腸桿菌的不可培養(yǎng)狀態(tài)進行試驗，發(fā)現(xiàn)當(dāng)可培養(yǎng)菌數(shù)降為零時，與正常狀態(tài)細菌相比，誘導(dǎo)后菌株多數(shù)仍為呈現(xiàn)綠色熒光的活菌，活菌數(shù)遠遠超過死菌數(shù)，并且菌體形態(tài)多樣，每份樣品中至少存在兩種不同“顆粒”，結(jié)合熒光圖像可以確知桿狀、球狀或球桿狀菌體。由此表明，試驗菌株在可培養(yǎng)數(shù)為零時就已進入了 VBNC 狀態(tài)。流式細胞術(shù)和熒光染色的聯(lián)合運用可客觀評價細菌的活性狀態(tài)，能較準(zhǔn)確分析出活死菌的數(shù)量或兩者數(shù)量的比例關(guān)系，但也存在一定缺陷。該方法雖能如實反映某一微生物區(qū)系中的細菌總數(shù)、存活狀態(tài)，以及活死細胞數(shù)量關(guān)系等，但卻無法鑒定和識別某一具體的微生物，尤其是處于 VBNC 狀態(tài)的細菌。此外，流式細胞儀分析樣品所需的熒光染料較多，劑量較大，價格昂貴，不適于大批量樣品檢測。

　　3.2 PMA/EMP-qPCR

　　該方法利用 qPCR 和生物染料 PMA/EMA 的結(jié)合，實現(xiàn)了檢測活死菌的目的。PMA/EMA 與 DNA 結(jié)合的作用機制尚未完全闡明，可能是以下因素綜合作用的結(jié)果：(1)PMA/EMA 不能通透細胞膜，只能選擇性地修飾死細胞“暴露”的 DNA(細胞壁和細胞膜已破損的細胞);(2)一旦進入細胞內(nèi)，染料插入核酸中，在暴露于強可見光下，染料上的疊氮基團生成高反應(yīng)性的 Nitrene 基，很容易在結(jié)合部位與碳氫化合物結(jié)合生成穩(wěn)定牢固的共價氮碳鍵，從而形成穩(wěn)定的 DNA 修飾;(3)該修飾強烈抑制 PCR 中的連續(xù) DNA 擴增。因此，通過這種機制，EMA 或 PMA 可以將死細胞優(yōu)選地嵌入 DNA 并防止死細胞隨后的 DNA 通過 PCR 擴增(圖 1)[11]， 而當(dāng) PMA/EMA 等核酸染料在強光作用下，同 DNA 偶聯(lián)結(jié)合，強光也會促使多余的核酸染料同水分子結(jié)合。剩余的羥胺(Hydroxylamine)不具有活性，因此完整細胞內(nèi)的 DNA 在提取過程中不會受到核酸染料影響。經(jīng)過核酸染料的鑒別，后續(xù)的 PCR 能特異性擴增，實現(xiàn)有效鑒別活菌的目的。

　　PMA/EMA -PCR 檢測已被用于檢測食源性人獸共患病病原 [12-14] 。Andreas 等 [15] 利用 EMA 對細菌進行預(yù)處理后，分別用微陣列技術(shù)和 qPCR 技術(shù)檢測活菌數(shù)，并對二者結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法都可以有效檢測出樣本中的活菌含量，結(jié)果高度一致。

　　4 PMA-qPCR 活菌檢測技術(shù)驗證

　　4.1 生物染料選擇

　　PMA 為熒光染料 PI 的結(jié)構(gòu)類似物，用于活死菌檢測時與 EMA 的作用原理相似，但是二者穿透細胞的能力有較大區(qū)別。盡管 EMA/PMA 作用機制相同，但相對來說，EMA 在信號抑制方面比 PMA 效果好，而 PMA 在判斷活死菌的準(zhǔn)確性上比 EMA 效果好。研究表明，EMA 可穿透具有完整膜的細胞 [16-17] 。完整細胞攝取 EMA 的程度主要取決于細菌種類。這個問題對 EMA 的使用造成了嚴(yán)重限制。因此，對 EMA 的替代物 PMA 進行了研究 [16] 。研究表明，與 EMA 相反，PMA 被有效地從具有完整細胞膜的細胞排除，這可能是由于正電荷的增加。它適用于廣泛的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌，因此選擇 PMA 作為生物染料，構(gòu)建 PMA-qPCR 檢測方法。

　　4.2 PMA-qPCR 在副溶血性弧菌檢測中的應(yīng)用

　　根據(jù)實驗室的研究基礎(chǔ)，建立針對副溶血弧菌 PMA-qPCR 活菌檢測技術(shù)，選擇 toxR 作為目的基因，設(shè)計引物及探針(表 1)。

　　為了驗證 PMA 的效果，設(shè)計了 4 組試驗，分 別 是 活 菌(PMA)、 活 菌(W/O PMA)、 死菌(PMA)、 死 菌(W/O PMA)， 細 菌 濃 度 為5×106 CFU/mL，死菌用 80 ℃處理。DNA 用試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302，TIANGEN)提取。W/O PMA 組提取 DNA 后直接進行 qPCR， PMA 組用 PMA 處理，終濃度為 10 μg/mL，充分混勻后在黑暗中處理 3 min，再將菌液放置 BLU-V system(QIAGEN)中在 60 光照強度下處理 2 min，使 PMA 和 DNA 充分結(jié)合，再進行 qPCR?？梢钥吹綕舛葹?5.0×106 CFU/mL 時，PMA 能夠充分抑制死菌的擴增，從而區(qū)分活菌和死菌(圖 2)。

　　試驗數(shù)據(jù)表明，將 PMA-qPCR 結(jié)合，實現(xiàn)副溶血性弧菌活菌的快速檢測是可行的。在實際樣品檢測中可減少假陽率，所以將 PMA 應(yīng)用于副溶血性弧菌的快速檢測具有很好的應(yīng)用前景，針對不同食品基質(zhì)中副溶血性弧菌的檢測也有待于學(xué)者們的進一步研究。近年來新型的 LAMP 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)與 PMA 結(jié)合降低了對試驗器材的要求，雖然靈敏度略低于 PMA-qPCR，但更簡單、經(jīng)濟，特別適合資源有限的機構(gòu)對病原體檢測的需要，商品化潛力更大。

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　　5　小結(jié)

　　傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為經(jīng)典方法仍是目前食源性人獸共患病病原檢測的主要手段，但因其檢測周期長，與食品的高效流通產(chǎn)生了矛盾。以檢測新陳代謝產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)的活菌檢測技術(shù)雖然具有檢測速度快的優(yōu)點，但卻存在假陽性率高、檢測靈敏度低、操作技術(shù)要求高等弊端，僅適用于小范圍或某些特殊菌體的高效快速檢測。

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