DNA甲基化對細(xì)胞周期的調(diào)控

　　摘要 細(xì)胞周期(cell cycle)是一種非常復(fù)雜和精細(xì)的調(diào)節(jié)過程, 該過程是連續(xù)而不可逆的。細(xì)胞周期紊亂與很多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān), 如腫瘤等。目前的研究發(fā)現(xiàn), 表觀遺傳學(xué)(epigenetics)可以通過影響細(xì)胞周期關(guān)鍵性調(diào)控因素而調(diào)控細(xì)胞周期。DNA甲基化(DNA methylation)是最常見的表觀遺傳修飾方式, 其在基因的轉(zhuǎn)錄、基因組的穩(wěn)定性和細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。因此, 該文重點對近年來DNA甲基化在細(xì)胞周期調(diào)控中的研究進(jìn)展作一綜述, 以期為提高腫瘤等疾病的臨床診斷和治療水平提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞 表觀遺傳學(xué); DNA甲基化; 細(xì)胞周期

　　表觀遺傳學(xué)(epigenetics)修飾是指在DNA序列沒有發(fā)生變化的情況下, 基因功能發(fā)生可遺傳變化, 并最終導(dǎo)致了表型的變化。表觀遺傳學(xué)修飾的方式主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA、染色質(zhì)重塑及基因組蛋白印記。DNA甲基化(DNA methylation)是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳修飾之一[1], 它在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平、染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、基因印記和染色體失活等方面發(fā)揮重要的作用[2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn), DNA甲基化異常會導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂, 從而引起疾病的發(fā)生, 如腫瘤等。

　　1 DNA甲基化

　　DNA甲基化是哺乳動物基因組主要的表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化作用下, 將S-腺苷甲硫氨酸 (SAM)中的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上, 形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)[4]。已知哺乳動物體內(nèi)共有5種DNMTs家族成員: DNMT1、 DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。其中, DNMT1是維持甲基化酶, DNMT3A和DNMT3B是重新甲基化酶。研究發(fā)現(xiàn), DNMT1、DNMT3A和 DNMT3B除了能識別5-mC的生物功能外, 還參與了基因組中5-mC的維持和產(chǎn)生機(jī)制[5]。在脊椎動物中, CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點。其中, CpG島(CpG island)是指基因上富含CpG的序列, 常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近。

　　DNA甲基化對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)主要通過兩種途徑完成, 一是通過甲基化的CpG二核苷酸來影響 DNA結(jié)構(gòu), 進(jìn)而直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合; 二是甲基化結(jié)合蛋白(如MeCP2)與基因中甲基化的 CpG二核苷酸相結(jié)合, 誘導(dǎo)染色體的狀態(tài)改變, 從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化模式是動態(tài)的, 以適應(yīng)環(huán)境等的變化[6]。研究表明, 腫瘤等疾病是細(xì)胞周期異常性疾病, 異常甲基化影響細(xì)胞分裂的生物學(xué)穩(wěn)定性[7]。CpG島的高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因(如參與細(xì)胞周期的調(diào)控、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡等的基因) 沉默; CpG低甲基化可導(dǎo)致癌基因活化[8]。另外, 在腫瘤細(xì)胞中DNMTs的活性增高可導(dǎo)致未甲基化的抑癌基因啟動子CpG島的甲基化程度增高[9]。

　　2 細(xì)胞周期及其調(diào)控

　　細(xì)胞周期(cell cycle)是指正常連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束的過程。根據(jù)各個時期的特點不同, 它可以將遺傳信息 DNA精確地復(fù)制并通過有絲分裂的方式分配到子代細(xì)胞中。細(xì)胞周期包括靜止期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2 期)和有絲分裂期(M期)。真核細(xì)胞經(jīng)常受各種不利環(huán)境因素(如電離輻射、化學(xué)毒物、紫外線等)的影響而導(dǎo)致DNA突變, 從而引起腫瘤及其他疾病的發(fā)生。為確保細(xì)胞周期的正常運行和遺傳信息的穩(wěn)定遺傳, 細(xì)胞在長期的進(jìn)化過程中逐漸形成了一整套細(xì)胞周期正常運行的機(jī)制, 其中最重要的是細(xì)胞周期檢測點, 也被稱為DNA損傷檢測點。數(shù)據(jù)顯示, 研究最多的是G1/S期檢測點、G2/M期檢查點、中/后期檢查點(又稱紡錘體組裝檢查點)。這些檢測點使細(xì)胞周期進(jìn)程減慢或阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程, 以提供給細(xì)胞充足的時間用于修復(fù)受損的DNA, 從而保證細(xì)胞周期有序運行, 以應(yīng)對不利因素的影響。然而, 不利的環(huán)境等可能引起檢測點調(diào)控異常, 從而導(dǎo)致腫瘤[10]、帕金森病[11]、阿爾茨海默病[12]等疾病的發(fā)生。

　　3 DNA甲基化對細(xì)胞周期檢測點的調(diào)控

　　3.1 DNA甲基化對G1/S檢測點的調(diào)控

　　細(xì)胞周期中G1時程的長短與細(xì)胞增殖分化狀態(tài)密切相關(guān)[13]。Gl期檢查點是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵, Gl期細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)很可能引起細(xì)胞周期失調(diào), 從而促進(jìn)疾病的發(fā)生。細(xì)胞周期的調(diào)控是通過有正向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)與負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitions, CDKI)相互作用來實現(xiàn)的。CDK使抑癌基因Rb的蛋白產(chǎn)物磷酸化, 使細(xì)胞進(jìn)入S期; 而CDKI 則抑制CDK活性, 阻斷Rb磷酸化, 使細(xì)胞停滯于G1 期, 進(jìn)而發(fā)生分化、凋亡或進(jìn)入靜止期。p16、p27、 p21、p57、p53、PENT等基因是細(xì)胞生長周期中的負(fù)調(diào)節(jié)因子, 主要參與G1/S檢測點的調(diào)控。它們與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。

　　3.1.1 p16 p16是一種抑癌基因, 位于人類第9號染色體21號短臂上, 包含2個內(nèi)含子和3個外顯子。 pRb是遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)的抑癌產(chǎn)物, 當(dāng)CyclinD與相應(yīng)CDK結(jié)合為激酶復(fù)合物時可對 pRb磷酸化, 磷酸化的pRb可釋放其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 E2F, E2F因子控制并參與細(xì)胞增生、生長、分化、凋亡基因的表達(dá), 這些基因的產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S 期, p16與cyclinD競爭結(jié)合CDK4/6使其失活, 從而抑制Rb蛋白磷酸化, 進(jìn)而阻止細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S 期[14]。研究發(fā)現(xiàn), p16基因的主要失活機(jī)制是p16基因啟動子區(qū)的超甲基化, CpG島的超甲基化抑制p16 轉(zhuǎn)錄, 進(jìn)而導(dǎo)致其表達(dá)產(chǎn)物p16蛋白的缺失[15]。相反, CPG島低甲基化可使p16基因回復(fù)正常的轉(zhuǎn)錄[16]。研究表明, p16基因超甲基化使cyclinD依賴性蛋白激酶的活性增高, 導(dǎo)致Rb蛋白異常磷酸化, 從而使細(xì)胞繞過正常細(xì)胞周期檢查點增加細(xì)胞增殖和基因組的不穩(wěn)定性; 同時, p16基因超甲基化可激活cyclinDlCDK4/CDK6-PRb-E2F的環(huán)路, 使其無限制反復(fù)進(jìn)行, 使細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期, 最終導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖及腫瘤的發(fā)生[17-18]。Umemura等[19]的研究表明, 血漿中p16基因啟動子甲基化可在早期肺癌中被發(fā)現(xiàn), 提示抑癌基因甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件。

　　3.1.2 p27 p27基因定位于染色體12p12~13.1, 其編碼的蛋白質(zhì)含有198個氨基酸, 由2個外顯子和2個內(nèi)含子組成。研究表明, G1期是其主要作用點, 具有阻止細(xì)胞通過G1/S期轉(zhuǎn)化的“關(guān)卡”作用。p27對 CDK的抑制作用表現(xiàn)為三方面: 即p27可抑制CDK 的激活過程、p27也可抑制已經(jīng)激活的cyclin/Cdk的激酶活性、p27還可通過阻止Rb蛋白磷酸化控制細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)變的進(jìn)程。DNA甲基調(diào)控主要通過 DNMTs, 該酶作用于p27甲基化酶位點Sma I、Hha I、 Ava I。三個酶的作用位點位于DNA的胞嘧啶鳥瞟呤富含區(qū), 該區(qū)域與RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄基因的啟動子有60%的一致性, 甲基化DNA的胞嘧啶干擾了反式作用因子, 使p27的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生障礙[20], 抑制了p27蛋白和mRNA的表達(dá), 導(dǎo)致p27基因沉默, 使細(xì)胞大量分化和增生。

　　3.1.3 p21 p21蛋白是CIP家族中的一員, 人類的 p21基因位于6p21.2, 全長約11 Kb, 含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。它是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子。當(dāng)DNA損傷發(fā)生在Gl期時, p21可通過抑制CDK活性來阻止細(xì)胞進(jìn)入S期, 從而抑制DNA復(fù)制; 當(dāng)DNA損傷發(fā)生在S期時, p21可通過使DNA聚合酶的相關(guān)因子失活而抑制DNA合成, 從而使細(xì)胞修復(fù), 保證遺傳物質(zhì)準(zhǔn)確地傳遞給子代, 從而避免了由于DNA損傷的累積而導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生的可能性[21]。研究表明, DNA甲基化和組蛋白乙?；墒筽21基因失活[22]。其中, 由于在轉(zhuǎn)錄起始位點周圍p21啟動子含有高密度的甲基化CpG二核苷酸聚集[23], 因此易發(fā)生甲基化。此外, p21與Cyclin、 CDK和PCNA以四聚體形式存在, 其中p21蛋白在其第144~151氨基酸上存在PCNA結(jié)合區(qū)域。PCNA是一種分子量為36 kDa的蛋白質(zhì), 為DNA聚合酶的輔助蛋白。p21影響PCNA的功能主要依賴于其抑制了PCNA和其他功能蛋白的結(jié)合。目前發(fā)現(xiàn)至少有兩種DNA代謝酶可以與p21競爭PCNA的結(jié)合, 其中包括DNMT1。DNMT1可以直接和PCNA結(jié)合, 它們的結(jié)合會被p21蛋白第141~160位氨基酸殘基阻斷, 因此, DNA復(fù)制過程中p21蛋白可以調(diào)控DNA甲基化的水平。所以通常認(rèn)為, 在哺乳動物細(xì)胞中p21對 DNMT1與PCNA結(jié)合是負(fù)調(diào)控[24-25], p21從PCNA復(fù)合物中的丟失可引起DNA損傷修復(fù)期間甲基化的異常增加[26]。

　　3.1.4 p57 人類的p57基因定位于11p15.15上, 含有4個外顯子和3個內(nèi)含子, 其中, 2個外顯子位于編 碼 區(qū) 內(nèi)。p57與p21、p27蛋白同源性在40%以上, p57、p21、p27共享一個N末端區(qū), 以此結(jié)合并抑制周期蛋白-CDK復(fù)合物的激酶活性。它主要抑制 CCNE-CDK2、CCNE-CDK3、CCNA-CDK2、 CCND-CDK2等。G1期 和S期激酶復(fù)合物[27]阻 止 DNA合成和細(xì)胞進(jìn)入S期來抑制細(xì)胞增殖。異常的啟動子甲基化修飾, 能導(dǎo)致p57基因沉默。研究表明, 與基因沉默相關(guān)的不是CpG島的邊緣區(qū)域, 而是轉(zhuǎn)錄起始位點周圍的區(qū)域(300~400 bp)密集甲基化[28]。 Kuang和他的同事[29]進(jìn)行的一項研究發(fā)現(xiàn), 在不同的白血病細(xì)胞系中, 有不同的啟動子甲基化狀態(tài)。在 p57基因啟動子甲基化的白血病細(xì)胞系中, p57過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長顯著停滯和明顯的細(xì)胞凋亡, p57部分甲基化只導(dǎo)致細(xì)胞生長的適度抑制而對細(xì)胞凋亡沒有影響。這表明, p57的抑癌特性與其細(xì)胞的甲基化狀態(tài)相關(guān)。

　　3.1.5 p53 哺乳動物細(xì)胞在受到DNA損傷后, 細(xì)胞周期的進(jìn)程將會停滯于兩個關(guān)鍵點, 即G1/S和G2/ M檢測點。抑癌基因p53主要在G1檢查點上發(fā)揮重要作用。p53作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在DNA損傷、癌基因活化、應(yīng)激等作用下, 一方面與下游靶基因的 DNA特異性結(jié)合來激活靶基因的轉(zhuǎn)錄, 另一方面激活的p53通過細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式防止腫瘤的發(fā)生。轉(zhuǎn)錄因子p53翻譯后要經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工與修飾, 最近研究發(fā)現(xiàn), 甲基化修飾是p53 的活性調(diào)節(jié)方式之一, 對維持p53的活性與穩(wěn)定性有極其重要的影響[30]。一個特定的、單一的賴氨酸甲基化就可以決定p53的活性, 其中, 轉(zhuǎn)錄因子p53羧基末端的K372位點被SET9甲基化可促進(jìn)p53表達(dá), 導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯甚至引起凋亡。有研究表明, p53產(chǎn)生的效應(yīng)和甲基化位點相關(guān), 如p53羧基末端K370 位點被甲基轉(zhuǎn)移酶Smyd2甲基化后, 會阻遏p53蛋白與DNA的結(jié)合, 抑制p53的轉(zhuǎn)錄[31]。此外, p53的活性還與該位點甲基化程度密切相關(guān)。在DNA復(fù)制過程中, DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑通過與DNMTs共價結(jié)合, 抑制DNMTs的甲基化作用, 使沉默基因重新表達(dá)[32]。由于p53高頻率的遺傳修飾和功能的雙重性, 因此, 成為迄今為止最重要的腫瘤抑制因子。當(dāng) DNA損傷時, p53負(fù)責(zé)細(xì)胞周期阻滯。當(dāng)損傷不能被修復(fù)時, p53會激活一系列導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的事件。研究表明, p53基因在所有類型的白血病中高甲基化, 因此, p53可能是癌癥甲基化的潛在靶標(biāo)[33]。

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　　p53基因?qū)S持細(xì)胞的周期起重要作用。一方面, p53基因誘導(dǎo)產(chǎn)生的p21和Gadd45可與PCNA結(jié)合, 修復(fù)損傷的DNA; 另一方面, p53基因還可以通過與RPA結(jié)合而抑制RPA與DNA復(fù)制起始點的結(jié)合, 在G1后期調(diào)節(jié)DNA復(fù)制起始復(fù)合物的合成, 在S期對細(xì)胞進(jìn)行負(fù)調(diào)控。

　　3.1.6 PENT 第10號染色體缺失性的磷酸酶及張力蛋白同源(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)基因位于人類染色體 10q23.3。PTEN是第一個發(fā)現(xiàn)具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因, 它通過對3,4,5-三磷酸肌醇(PIP3) 的去磷酸化作用來影響PI3K/Akt信號通道, 激活 Caspase-9及p27等蛋白活性, 抑制CDKs活性, 從而使細(xì)胞周期停滯在G1期, 引起腫瘤細(xì)胞的凋亡, 從而發(fā)揮其抗腫瘤作用[34-35]。高表達(dá)的PTEN能通過抑制CDK活性使Rb保持去磷酸化并結(jié)合E2F的狀態(tài), 從而抑制細(xì)胞增殖。PTEN蛋白功能的缺失可導(dǎo)致 PI3K下游信號通路過度激活, 引起絲氨酸/蘇氨酸激酶和蛋白激酶B(Akt/PKB)堆積。

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