多指標(biāo)綜合加權(quán)分析法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵豆粕工藝

　　摘要：運(yùn)用正交設(shè)計(jì)L9（34）與多指標(biāo)綜合加權(quán)分析方法優(yōu)化3種益生復(fù)合菌發(fā)酵豆粕的工藝，采用接種量（A）、環(huán)境溫度（B）、料水比（C）、發(fā)酵菌種（D）為處理因素，以還原糖、乳酸、氨基酸含量等作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用Minitab17軟件以及多指標(biāo)試驗(yàn)公式法進(jìn)行加權(quán)數(shù)據(jù)處理，優(yōu)化豆粕的固體發(fā)酵工藝參數(shù)。結(jié)果顯示，1）經(jīng)過加權(quán)分析，中性蛋白酶權(quán)重系數(shù)最高，其次為還原糖（1.719）和乳酸（1.590），粗脂肪權(quán)重系數(shù)最低。說明本試驗(yàn)中性蛋白酶、還原糖以及乳酸對(duì)發(fā)酵豆粕的品質(zhì)影響較大。2）通過綜合評(píng)分公式對(duì)9個(gè)處理組數(shù)據(jù)分析得到：T9組綜合評(píng)分最高（0.9863），T1組（0.9654）和T8組（0.9626）次之，表明在T9組合（A3B3C2D1）條件下發(fā)酵豆粕，所選8項(xiàng)考察指標(biāo)綜合水平達(dá)到最高。因此擬選T9組合為最佳發(fā)酵工藝組合；3）均值回應(yīng)表顯示影響豆粕發(fā)酵工藝的因素依次為：發(fā)酵菌種>料水比>環(huán)境溫度>接種量，其中發(fā)酵菌種和料水比為顯著影響因素（P<0.05），而接種量和環(huán)境溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著。從資源節(jié)約以及生產(chǎn)實(shí)際角度考慮，將T9組發(fā)酵工藝A3B3C2D1優(yōu)化為A1B2C2D1，即接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%，環(huán)境溫度30℃，料水比質(zhì)量為2∶1，發(fā)酵菌種配比為1∶1∶1。4）Minitab17軟件對(duì)優(yōu)選工藝A1B2C2D1進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示優(yōu)選工藝綜合評(píng)分高于擬選工藝A3B3C2D1綜合評(píng)分（0.9863）。驗(yàn)證試驗(yàn)得出各指標(biāo)產(chǎn)出與預(yù)期結(jié)果相符，表明該優(yōu)化工藝合理、可行，各指標(biāo)產(chǎn)出率較高，為豆粕發(fā)酵工藝的確定提供了參考依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：飼料；農(nóng)產(chǎn)品加工；發(fā)酵；綜合加權(quán)分析法；正交試驗(yàn)；發(fā)酵豆粕

　　0引言

　　水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展對(duì)魚粉需求量逐年增大，加之餌料漁業(yè)資源捕撈過度，導(dǎo)致魚粉價(jià)格不斷升高，因此，用植物蛋白代替魚粉等動(dòng)物蛋白頗受關(guān)注[1-4]。豆粕是大豆加工后得到的一種副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)，是水產(chǎn)飼料行業(yè)應(yīng)用最廣泛的植物蛋白源[5-8]，但由于豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸不平衡、結(jié)構(gòu)致密造成的適口性差和消化率偏低等限制了其應(yīng)用價(jià)值。許多研究表明，有益微生物發(fā)酵豆粕可以降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度，改善養(yǎng)殖動(dòng)物腸道菌群，增強(qiáng)免疫功能[9]；大分子蛋白質(zhì)也可以在微生物作用下降解為容易被養(yǎng)殖動(dòng)物吸收的多肽、小肽及游離氨基酸[10]；微生物發(fā)酵也可以降解部分碳水化合物，使豆粕致密結(jié)構(gòu)變得疏松，減少苦味的產(chǎn)生[11]，從而增加豆粕適口性，提高水產(chǎn)動(dòng)物的飼料利用率[12-13]。毛銀等[14]采用一株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）進(jìn)行豆粕發(fā)酵研究，產(chǎn)物中含有6種有機(jī)酸，改善了豆粕的氣味性和適口性，還可以防止豆粕變質(zhì)。Li等[15-16]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)開展了枯草芽孢桿菌ZC1發(fā)酵豆粕的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究，研究發(fā)現(xiàn)在攪拌速率150r/min、通氣量5L/min、環(huán)境溫度37℃時(shí)，中性蛋白酶酶活力和大豆肽轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了852.5U/mL和76.73%。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1發(fā)酵菌種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）NHS1，1.5×109cfu/mL；乳酸菌NHS03（Lacticacidbacteria），2×109cfu/mL；海洋紅酵母菌NHS05（Marineredyeast），8×108cfu/mL，3種菌種均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所分離，鑒定并保藏。

　　1.1.2發(fā)酵底物豆粕（東莞市富之源飼料蛋白開發(fā)有限公司）1.2方法1.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以接種量（A）、環(huán)境溫度（B）、料水比（C）、發(fā)酵菌種（D）為考察因素，其中接種量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算，料水比和發(fā)酵菌種比例均以質(zhì)量比值計(jì)算。參考以往研究者研究[18,20]以及實(shí)際生產(chǎn)條件設(shè)計(jì)各因素水平，發(fā)酵菌種水平選擇枯草芽孢桿菌NHS1（Bacillussubtilis）、乳酸菌NHS03（Lacticacidbacteria）、海洋紅酵母菌NHS05（Marineredyeast）三者不同比例（表1）。以發(fā)酵后豆粕的粗脂肪、還原糖、乳酸、中性蛋白酶、總氨基酸、干物質(zhì)回收率、不飽和脂肪酸、粗蛋白為綜合指標(biāo)。每個(gè)因素3個(gè)水平（見表1），按照L9（34）正交試驗(yàn)表（見表2）制作總量為3kg的發(fā)酵豆粕，平均分成3份，分別裝入發(fā)酵袋中，密封培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間為48h。各處理組以T1、T2、T3，…，T9表示。發(fā)酵完成后樣品進(jìn)行低溫干燥（含水率為8.5%），進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1正交試驗(yàn)權(quán)重系數(shù)及綜合評(píng)分的確定

　　選擇L9(34）表，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3，表4。由于本次正交設(shè)計(jì)采用了多個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行分析，所以采用多指標(biāo)試驗(yàn)公式法[28]進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。以Xij表示第i次試驗(yàn)第j個(gè)指標(biāo)的測(cè)定值（即Xij表示正交試驗(yàn)的第i次試驗(yàn)的第j個(gè)指標(biāo)的測(cè)定含量），首先以各指標(biāo)的最大值作為參照，對(duì)同一指標(biāo)各數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，Dij表示第j個(gè)指標(biāo)下的第i個(gè)測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。Dij=Xij/(Xj)max，其中i=1，2，...，9；j=1,2，...，8。再按各指標(biāo)的重要程度和各組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差確定權(quán)重系數(shù)，F(xiàn)j=Ej×RSD/RSDj（見表3），其中RSD為粗脂肪的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSDj為第j個(gè)指標(biāo)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，由于各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的作用都比較重要，故重要程度Ej定為1。Pi=Σ(Fj×Dij）/ΣFj，計(jì)算所得的兼顧各項(xiàng)指標(biāo)綜合評(píng)分公式Pi越大越好，數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表5，表6。

　　2.2豆粕發(fā)酵工藝綜合評(píng)分結(jié)果與分析

　　本試驗(yàn)選擇8種生產(chǎn)指標(biāo)作為考察發(fā)酵豆粕綜合品質(zhì)指標(biāo)，通過多指標(biāo)試驗(yàn)公式法科學(xué)計(jì)算得出各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)（見表3）。其中中性蛋白酶權(quán)重系數(shù)最高（1.773），說明中性蛋白酶對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)影響較大，因此分配權(quán)重較大；而粗脂肪權(quán)重系數(shù)最低，說明粗脂肪對(duì)發(fā)酵豆粕品質(zhì)影響較小，分配權(quán)重系數(shù)相對(duì)較小。再通過公式計(jì)算出各試驗(yàn)組的綜合評(píng)分并對(duì)評(píng)分進(jìn)行排序（見表4）。結(jié)果顯示：T9組綜合評(píng)分最高（0.9863），T1組綜合評(píng)分次之（0.9654），T7組綜合評(píng)分最低（0.8260）；T9組直觀排序?yàn)榈?，因此在本試驗(yàn)中T9組（A3B3C2D1）在各試驗(yàn)組中發(fā)酵工藝最佳。綜合評(píng)分Pi的均值回應(yīng)表（表5）顯示，正交試驗(yàn)中各因素水平的均值以及極差，通過極差排秩可以直觀得出各因素對(duì)發(fā)酵豆粕綜合品質(zhì)影響程度各不相同，D因素影響最大，C因素影響次之，A因素影響最小，因此各因素的影響程度依次為D>C>B>A，即發(fā)酵菌種>料水比>環(huán)境溫度>接種量。綜合評(píng)分Pi方差分析結(jié)果（表6）表明：各因素對(duì)發(fā)酵豆粕綜合品質(zhì)影響顯著程度不同，D因素（發(fā)酵菌種）和C因素（料水比）P值分別為0.021和0.046，P值均小于0.05，為顯著影響因素；A、B因素的P值大于0.05，說明A、B因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著影響，即接種量和環(huán)境溫度對(duì)發(fā)酵豆粕綜合品質(zhì)的影響不大。因此，考慮節(jié)約試驗(yàn)資源，T9組合（A3B3C2D1）中A因素選擇較低水平，B因素選擇與外界環(huán)境相符溫度。將發(fā)酵工藝A3B3C2D1最終優(yōu)化為A1B2C2D1，即本試驗(yàn)最終發(fā)酵工藝為：接種量1%，環(huán)境溫度30℃，料水比2∶1，發(fā)酵菌種枯草芽孢桿菌NHS1∶乳酸菌NHS03∶海洋紅酵母菌NHS05=1∶1∶1。

　　3討論

　　3.1發(fā)酵豆粕對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子以及氨基酸平衡等豆粕品質(zhì)的影響

　　豆粕雖然在植物蛋白含量高、原料充足中等多方面存在優(yōu)勢(shì)，但抗?fàn)I養(yǎng)因子、氨基酸不平衡、適口性差和消化率偏低等因素限制了其應(yīng)用。豆粕經(jīng)過微生物發(fā)酵后，一方面能產(chǎn)生大量乳酸和芳香族化合物，改善飼料風(fēng)味，適口性好，可增加動(dòng)物食欲[41]。同時(shí)產(chǎn)生大量蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖化酶等消化酶，有助于提高豆粕的消化利用率[42]。何玉華等[43]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵豆粕能夠顯著改善豆粕的風(fēng)味和適口性，并在水貂日糧中添加23%發(fā)酵豆粕可有效提高有機(jī)物和粗脂肪的采食量。另一方面微生物發(fā)酵豆粕可去除多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[44]。劉媛媛[45]發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)發(fā)酵后胰蛋白酶抑制因子、大豆凝聚素、脂肪氧化酶、致甲狀腺腫素等均被完全降解。脲酶雖然是一種熱不穩(wěn)定性的酶，但在某種特定條件下可以被激活，從而影響動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的利用，甚至?xí)＜皠?dòng)物生命[46]。豆粕中的胰蛋白酶抑制因子含量與其中的脲酶含量呈正相關(guān)關(guān)系，因此通過測(cè)定脲酶活性可間接評(píng)估豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量[47]。本試驗(yàn)中經(jīng)過最佳發(fā)酵工藝發(fā)酵豆粕，脲酶基本消除，從側(cè)面說明胰蛋白酶抑制因子降解達(dá)到較高水平。另外，豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后，使大分子蛋白分解為易吸收的小分子蛋白、小肽分子以及氨基酸分子。有學(xué)者利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕后發(fā)現(xiàn)游離氨基酸差異顯著，大部分必需氨基酸有所增加，其中異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸較發(fā)酵前增加2～7倍[48]。本試驗(yàn)中各氨基酸含量在發(fā)酵后均有不同程度增加，其中賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸增幅相對(duì)較大，與Dai研究結(jié)果不同，可能與發(fā)酵菌種以及發(fā)酵工藝不同有關(guān)。

　　3.2多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分分析法

　　多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)是指人們根據(jù)不同的評(píng)價(jià)目的，選擇相應(yīng)的評(píng)價(jià)形式，據(jù)此選擇多個(gè)因素或指標(biāo)，并通過一定的評(píng)價(jià)形式，據(jù)此選擇多個(gè)因素或指標(biāo)，并通過一定的評(píng)價(jià)方法，將多個(gè)評(píng)價(jià)因素或指標(biāo)轉(zhuǎn)化為能反映評(píng)價(jià)對(duì)象總體特征的信息[49]。其中評(píng)價(jià)指標(biāo)與權(quán)重系數(shù)的確定將直接影響綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果[50]。在以往進(jìn)行微生物發(fā)酵豆粕的工藝優(yōu)化研究中，研究者一般只采取一個(gè)參考指標(biāo)[42]，這樣就造成了試驗(yàn)結(jié)果具有一定的片面性。本研究在指標(biāo)的選取以及數(shù)據(jù)的處理等方面，引入了綜合分析指標(biāo)的概念，將具有不同考察范圍的指標(biāo)轉(zhuǎn)化為一個(gè)可以量化的數(shù)值。因此這種多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法可以較好的避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)的片面性，從而使指標(biāo)分析更加公正、全面，同時(shí)對(duì)關(guān)鍵性影響因素也給予了相應(yīng)的側(cè)重，使結(jié)果分析更為科學(xué)、客觀。多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法在中藥提取研究中應(yīng)用較廣[51-52]，而在微生物發(fā)酵方面的應(yīng)用鮮有報(bào)導(dǎo)。目前在豆粕發(fā)酵工藝研究方面多利用正交設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析[53]，并多采用單一指標(biāo)評(píng)價(jià)分析結(jié)果，最終得到最佳發(fā)酵工藝。按照權(quán)數(shù)產(chǎn)生方法的不同，多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)方法可分為主觀賦權(quán)評(píng)價(jià)法和客觀賦權(quán)評(píng)價(jià)法兩大類。劉曉明[24]在研究乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌發(fā)酵不同飼料原料時(shí)采用了主觀賦權(quán)評(píng)價(jià)法，依據(jù)各指標(biāo)對(duì)發(fā)酵飼料質(zhì)量影響的大小給予不同的權(quán)重系數(shù)，這種方法主觀性比較強(qiáng)，易受人為因素的影響。而本研究中采用的是客觀賦權(quán)評(píng)價(jià)法，該方法能夠綜合考慮各指標(biāo)之間的相互關(guān)系，依據(jù)各指標(biāo)所提供的初始數(shù)據(jù)信息來確定權(quán)重，從而使評(píng)價(jià)結(jié)果更加精確，客觀性比較強(qiáng)，更具有說服力。

　　4結(jié)論

　　本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，利用多指標(biāo)試驗(yàn)公式法以及Minitab17軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出最高綜合評(píng)分為0.9863，正交試驗(yàn)第9組A3B3C2D1為擬選發(fā)酵工藝。由于A、B因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果沒有顯著性影響，考慮節(jié)約試驗(yàn)資源，因此選擇A1B2C2D1為最佳發(fā)酵工藝條件，即接種量為1%，環(huán)境溫度30℃，料水比為2∶1，發(fā)酵菌種為枯草芽孢桿菌NHS1∶乳酸菌NHS03∶海洋紅酵母菌NHS05=1∶1∶1。本研究得出的最佳發(fā)酵工藝是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行的，后續(xù)在產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中進(jìn)一步優(yōu)化和微調(diào)，進(jìn)一步改善發(fā)酵豆粕蛋白質(zhì)品質(zhì)，顯著降低抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高發(fā)酵豆粕的利用率。

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