不同產(chǎn)地槐米的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究

　　摘 要: 為了進(jìn)一步完善槐米的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并對(duì)不同產(chǎn)地槐米進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，本研究按照 2015 版《中華人民共和國藥典》方法測(cè)定水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和總黃酮;采用 HPLC 法測(cè)定槐米中蘆丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素 4 種成分的含量，并通過 SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。54 批槐米樣品的水分、總灰分和酸不溶性灰分均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);南方產(chǎn)槐米的浸出物及黃酮類成分含量均普遍高于北方產(chǎn)槐米。聚類分析和主成分分析將 54 批槐米聚為 3 類，分類結(jié)果與地域有較大關(guān)系。本研究較全面地評(píng)價(jià)了全國 54 個(gè)產(chǎn)地槐米的質(zhì)量，為槐米的產(chǎn)品開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞: 槐米;質(zhì)量評(píng)價(jià);聚類分析;主成分分析

　　槐米為豆科植物國槐 Sophora japonica L. 的干燥花蕾，具有清熱、涼血、止血的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明槐米具有保護(hù)心腦血管[2，3]、改 善 糖 尿病[4]、抗菌[5]、抗氧化[6]和抑制黑色素生成[7]等作用。槐米中含有大量的黃酮及其苷類成分，如蘆丁、水仙 苷、槲 皮 素、異 鼠 李 素、山 奈 酚、染 料 木 素等[8，9]。槐米的產(chǎn)地在中國分布范圍較廣，由于各地氣候、地形、土壤條件等不同，所產(chǎn)槐米質(zhì)量也不均一。李振志[10]等研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地槐米中蘆丁的含量有顯著性差異，其中以廣西桂林產(chǎn)含量最高。國槐的花期為 6 ～ 8 月，在不同時(shí)期，槐花中黃酮類成分的含量也有較大差異[11]。為了綜合開發(fā)槐米產(chǎn)品及保障用藥安全，有必要對(duì)各產(chǎn)地槐米藥材的質(zhì)量進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。Liu [8]等采用 UPLC-MS /MS法同時(shí)測(cè)定了槐米中 5 種黃酮類成分，但是檢測(cè)成本較高，不易推廣。本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定槐米中蘆丁、水仙苷、槲皮素和異鼠李素 4 種成分的 HPLC 方法，對(duì)不同產(chǎn)地槐米中 4 種成分含量進(jìn)行測(cè)定，并通過主成分分析法進(jìn)行評(píng)價(jià);參照 2015 版《中華人民共和國藥典》[1]對(duì)不同產(chǎn)地槐米藥材進(jìn)行水分和灰分的檢查以及浸出物和總黃酮的含量測(cè)定并采用聚類分析法進(jìn)行歸類。通過以上研究，更加全面地評(píng)價(jià)各地槐米的質(zhì)量，為槐米藥材的臨床使用和產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

　　1 儀器與試藥

　　儀器:Agilent 1260 高效液相色譜儀(Agilent 公司，美國;DAD 檢測(cè)器)，UV 2600 紫外分光光度計(jì) (島津公司，日本)，Milli(Q Integral 5 型純水儀(Millipoer 公司，美國)，BSA 124(S 型電子天平( Sartorius，德國)，KQ(250 DB 型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，中國)，8(10 型馬弗爐(沈陽節(jié)能電爐廠，中國)，XMTB 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 (上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，中國)，G2X(9240 MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，中國)。

　　對(duì)照品:蘆丁對(duì)照品(批號(hào):MUST(16070511，純 度: ≥ 99% )、槲 皮 素 對(duì) 照 品 ( 批 號(hào): MUST (16072203，純度:≥ 98% )、異鼠李素對(duì)照品(批號(hào): MUST(16092001，純度:≥ 98% )購自成都曼斯特生物科技有限公司;水仙苷對(duì)照品(批號(hào):TAQT( LR- LA，純度:≥ 93. 1% ) 購自中國食品藥品檢定研究院。

　　試劑:乙腈( TEDIA 公司，美國;色譜純)、甲醇 (TEDIA 公司，美國;色譜純)、醋酸(TEDIA 公司，美國;色譜純)，其它試劑均為分析純。

　　樣品產(chǎn)地:在全國范圍內(nèi)共收集樣品 54 批，詳細(xì)信息見表 1。樣品經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為豆科植物國槐 Sophora japonica L. 的干燥花蕾。

　　2 實(shí)驗(yàn)方法

　　2. 1 水分、灰分、浸出物及總黃酮的檢測(cè)

　　樣品處理及檢測(cè)方法按照《中華人民共和國藥典》[1]中相關(guān)方法進(jìn)行檢測(cè)。

　　2. 2 4 種黃酮類成分含量測(cè)定

　　2. 2. 1 色譜分析條件

　　色譜柱:Inertsil  ODS-3(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)。流動(dòng)相:乙腈(A)-1% 醋酸水溶液(B)，梯度洗脫，0 ～ 5 min，5% A;5 ～ 10 min，5% → 20% A;10 ～ 20 min，20% A;20 ～ 30 min，20% → 32% A;30 ～ 45 min，32% → 35% A;45 ～ 50 min，35% → 5% A; 50 ～ 55 min，5% A。流速 1. 0 mL /min，檢測(cè)波長 257 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 10 μL。

　　2. 2. 2 混合對(duì)照品溶液的制備

　　精密稱取對(duì)照品水仙苷 6. 04 mg、槲皮素 10. 18 mg、異鼠李素 3. 00 mg，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻;精密移取上述水仙苷溶液 2 mL、槲皮素溶液 2 mL、異鼠李素溶液 0. 5 mL 與蘆丁 9. 04 mg 置 10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得蘆丁濃度為 904. 0 μg /mL、水仙苷濃度為 120. 8 μg /mL、槲皮素濃度為 203. 6 μg / mL、異鼠李素濃度為 15. 0 μg /mL 的混合對(duì)照品溶液。再稀釋得到梯度濃度的混合對(duì)照品溶液。

　　2. 2. 3 供試品溶液的制備

　　精密稱取干燥槐米樣品粉末(過 60 目篩)0. 1 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇 50 mL，稱定質(zhì)量。于 25 ℃超聲處理(功率 400 W，頻率 40 kHz)30 min，冷卻，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，0. 45 μm 微孔濾膜濾過，取濾液即得。

　　2. 2. 4 方法學(xué)考察

　　2. 2. 4. 1 線性關(guān)系考察

　　將梯度濃度的混合對(duì)照品溶液按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以各對(duì)照品峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg /mL)為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁的線性方程為 Y =18. 872X + 34. 875，r = 0. 999 9;水仙苷的線性方程為 Y =9. 763X -1. 661，r = 0. 999 8;槲皮素的線性方程為 Y = 17. 583X - 14. 405，r = 0. 999 9;異鼠李素的線性方程為 Y = 16. 203X - 3. 285，r = 0. 999 9。結(jié)果表明，蘆丁在 56. 5 ～ 904. 0 μg /mL、水仙苷在 7. 6 ～ 120. 8 μg /mL、槲皮素在 1. 6 ～ 203. 6 μg /mL、異鼠李素在 0. 9 ～ 15. 0 μg /mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

　　2. 2. 4. 2 檢測(cè)限與定量限

　　配制一系列質(zhì)量濃度由高到低的對(duì)照品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以信噪比為 3 時(shí)考察檢測(cè)限、信噪比為 10 時(shí)考察定量限，結(jié)果表明蘆丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素的檢測(cè)限分別為 159、329、223、234 ng /mL，定量限分別為 556、940、 556、938 ng /mL。

　　2. 2. 4. 3 精密度試驗(yàn)

　　取同一混合對(duì)照品溶液按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄各成分的峰面積。結(jié)果蘆丁、水 仙 苷、槲 皮 素、異鼠李素峰面積 RSD 分 別 為 1. 26% 、2. 18% 、1. 27% 、2. 14% 、1. 58% ，表明儀器精密度良好。

　　2. 2. 4. 4 重復(fù)性試驗(yàn)

　　取同一來源槐米樣品，按“2. 2. 3”項(xiàng)下方法平行制備 6 份供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果蘆丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素峰面積RSD 分別為 1. 87% 、1. 90% 、1. 44% 、1. 34% ，表明本方法重現(xiàn)性良好。

　　2. 2. 4. 5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

　　取同一供試品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積。結(jié)果蘆丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素峰面積RSD 分別為 1. 11% 、1. 24% 、1. 99% 、1. 32% ，表明供試品溶液于 24 h 內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

　　2. 2. 4. 6 回收率試驗(yàn)

　　精密稱取已知含量的同一來源槐米樣品 6 份，每份 0. 05 g，分別精密添加與樣品中含量相當(dāng)?shù)奶J丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素對(duì)照品，按“2. 2. 3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 檢 測(cè)，計(jì)算得到蘆丁的平均加樣回收率為 100. 31% ，RSD 為 1. 73% ;水仙苷的平均加樣回收率為 103. 77% ，RSD 為 1. 85% ;槲皮素的平均加樣回收率為 100. 63% ，RSD 為 2. 75% ;異鼠李素的平均加樣回收率為 101. 93% ;RSD 為 2. 55% 。結(jié)果表明本方法的回收率良好。

　　3 結(jié)果與分析

　　3. 1 水分、灰分、浸出物及總黃酮的檢測(cè)

　　槐米樣品中水分、灰分、浸出物及總黃酮的檢測(cè)結(jié)果見表 2。結(jié)果顯示 54 批槐米樣品的水分含量在 4. 83% ～ 10. 81% 之間，均低于 11. 00% ，符合藥典規(guī)定;總灰分含量在 3. 42% ～ 8. 93% 之間，均低于 9. 00% ，酸不溶性灰分含量在 0. 73% ～ 2. 93% 之間，均 低 于 3. 00% ，符 合 藥 典 規(guī) 定。南 方 產(chǎn) 樣 品 30% 甲醇浸出物含量在 43. 69% ～ 55. 11% 之間，均符合藥典規(guī)定;北方產(chǎn)樣品 30% 甲醇浸出物含量在 32. 38% ～ 52. 56% 之間，差異較大，其中 BF-4、BF- 6、BF-9、BF-10 和 BF-24 的含量低于藥典對(duì)槐米浸出物 的 要 求。南方產(chǎn)槐米樣品中總黃酮含量在 20. 10% ～ 42. 98% 之間，均符合藥典規(guī)定;北方產(chǎn)樣品總黃酮含量在 9. 91% ～ 25. 55% 之間，僅有 7 批 (BF-2、BF-7、BF-8、BF-11、BF-13、BF-18 和 BF-24) 合格，說明南方產(chǎn)槐米樣品普遍優(yōu)于北方。

　　3. 2 4 種黃酮類成分含量測(cè)定

　　按“2. 2. 3”項(xiàng)下方法每個(gè)樣品平行制備 3 份供試品溶液，按“2. 2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。根據(jù)線性方程分別計(jì)算蘆丁、水仙苷、槲皮素和異鼠李素的百分含量，結(jié)果見表 3。

　　由結(jié)果可知，南方產(chǎn)槐米樣品中蘆丁含量在 18. 402 2% ～ 37. 801 1% 之間，均符合藥典規(guī)定;其中武漢(NF-1)產(chǎn)槐米中蘆丁含量最低，推測(cè)這與其處于平原地區(qū)，氣候與其他中南、西南高海拔產(chǎn)區(qū)差異較大有關(guān)。北方產(chǎn)樣品蘆丁含量在 5. 530 0% ～ 21. 879 5% 之間，其中約有一半不合格。

　　南方和北方樣品中水仙苷、槲皮素和異鼠李素含量也有較大差異。水仙苷含量分別為 0. 544 6% ～ 2. 802 8% 和 0. 124 2% ～ 1. 796 5% ;而槲皮素和異鼠李素含量在北方樣品中均出現(xiàn)了未檢出的情況，且明顯南方樣品優(yōu)于北方樣品。

　　3. 3 化學(xué)模式識(shí)別

　　3. 3. 1 聚類分析

　　浸出物、總黃酮及單個(gè)黃酮類成分含量是評(píng)價(jià)槐米質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究以浸出物、總黃酮含量、蘆丁、水仙苷、槲皮素和異鼠李素含量的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)為變量，運(yùn)用 SPSS 20. 0 軟件，以平方歐氏距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì) 54 批樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖 2。54 批樣品共被分為 3 大類，其中北方產(chǎn)槐米被聚為一類;南方產(chǎn)槐米可分為 2 類，產(chǎn)于湖南、云南、廣西的被歸為一類，產(chǎn)于重慶、四川的被歸為一類。結(jié)果表明，南、北方所產(chǎn)槐米質(zhì)量有較大差異，說明槐米的質(zhì)量受地域及氣候的影響較大。

　　3. 3. 2 主成分分析

　　運(yùn)用 SPSS 20. 0 軟件，以槐米中蘆丁、水仙苷、槲皮素、異鼠李素含量作為變量，以特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率作為判定依據(jù)，對(duì)不同產(chǎn)地槐米進(jìn)行主成分分析。根據(jù)降 維 結(jié) 果，共 挑 選 出 2 個(gè) 主 成 分 PC1、 PC2，特征值分別為 2. 036、1. 510。各成分方差貢獻(xiàn)值分 別 為 50. 893% 、37. 751% ，累 積 貢 獻(xiàn) 值 達(dá) 到 88. 644% ，具有較強(qiáng)的代表性，可用來評(píng)價(jià)槐米的質(zhì)量。

　　《不同產(chǎn)地槐米的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究》來源：《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2018年9期，作者：譚均; 李隆云; 王計(jì)瑞; 丁剛; 徐進(jìn)。

《不同產(chǎn)地槐米的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究》

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