益母草抗結(jié)核分枝桿菌成分的跟蹤分離

　　摘 要: 結(jié)核病分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核，其中子宮結(jié)核屬于肺外結(jié)核，是造成不孕的主要原因。益母草是我國傳統(tǒng)中藥，常用于婦科疾病的治療。在篩選中發(fā)現(xiàn)，益母草乙醇提取物具有抗結(jié)核分枝桿菌活性，經(jīng)活性跟蹤分離，從益母草乙酸乙酯萃取部位中分離得到具有抑制結(jié)核分枝桿菌的單體化合物 1，鑒定為益母草堿，抗結(jié)核桿菌的 MIC 值為 80 μg /mL。這一發(fā)現(xiàn)為治療子宮結(jié)核提供了新的線索。

　　關(guān)鍵詞: 益母草;益母草堿;結(jié)核分枝桿菌;活性成分

　　結(jié)核(tuberculosis，TB)是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的可侵犯全身各器官的一種慢性傳染病。結(jié)核分為肺結(jié)核和肺外結(jié)核，其中女性盆腔結(jié)核近年來有增長的趨勢[1，2]。女性盆腔結(jié)核是指女性盆腔包括盆腔生殖器官(卵巢、輸卵管、子宮)及盆腔腹膜與子宮周圍的結(jié)締組織的炎癥?；颊呖沙霈F(xiàn)消瘦、疲勞、發(fā)燒、出汗、乏力等癥狀，常伴隨盆腔痛、月經(jīng)異常、痛經(jīng)、閉經(jīng)、月經(jīng)量少等癥狀，是導(dǎo)致女性不孕的重要原因[3-6]。目前，主要使用抗癆藥物對女性盆腔結(jié)核實施治療，一線抗結(jié)核藥物缺乏子宮靶向性，必須長期服藥，由于這類藥物肝毒性明顯，患者往往不能堅持服藥，導(dǎo)致治療失敗。因此，研發(fā)子宮靶向性的抗結(jié)核新藥對盆腔結(jié)核的治療具有重要意義。

　　益母草是唇形科益母草屬植物益母草( Leonurus artemisia (Laur. )S. Y. Hu F)的新鮮或者干燥地上部分。古代文獻將益母草的功效歸屬于治療婦產(chǎn)科疾病，比如:《本草衍義補遺》說“益母草治產(chǎn)前產(chǎn)后諸疾”、《本草綱目》說“益母草治婦人胎產(chǎn)諸病”、《本草蒙筌》說“益母草總調(diào)胎產(chǎn)諸證”、《本草求真》說“益母草消水行血，去瘀生新，調(diào)經(jīng)解毒，為胎前胎后要劑”。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實踐中，益母草被制成 “益母草膏”、“益母草顆粒”、“益母草注射液”等劑型 ，用于治療痛經(jīng)、閉經(jīng)、子宮陰道出血，具有促進產(chǎn)后子宮復(fù)舊及清理產(chǎn)后子宮殘留物等功效[7-14]?？梢?，益母草對子宮及其附件的多種病理過程具有明顯的干預(yù)作用，那么，益母草是否具有子宮靶向性、是否具有抗子宮結(jié)核的作用? 迄今少見相關(guān)的文獻報道。

　　為發(fā)現(xiàn)具有子宮靶向性的抗結(jié)核藥物，我們對20 多種具有治療女性盆腔類疾病的中草藥進行了抗結(jié)核桿菌體外試驗，部分品種顯示出抗結(jié)核桿菌活性，其中益母草乙醇提取物在改良羅氏培養(yǎng)基中能抑制結(jié)核分枝桿菌生長。對益母草進行抗結(jié)核分枝桿菌活性跟蹤分離，得到活性單體 YMC04，報道如下。

　　1 材料與方法

　　1. 1 藥材

　　益母草(2 700 g)購自貴陽市和平藥房，為除根外的細葉益母草全株。

　　1. 2 儀器與試劑

　　核磁共振數(shù)據(jù)用 INOVA400 MHz 型超導(dǎo)核磁共振儀測定，TMS 作內(nèi)標(biāo);質(zhì)譜數(shù)據(jù)用 HP-5973 型質(zhì)譜儀測定;柱色譜用硅膠(200 ～ 300 目)、硅膠 H 和薄層色譜用硅膠 GF254均為青島海洋化工產(chǎn)品;改良羅氏培養(yǎng)基基礎(chǔ)(上海博微生物科技有限公司)， 7H9 肉湯(Difco)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1. 3 益母草的提取與活性跟蹤分離

　　1. 3. 1 益母草的提取與分段

　　益母草樣品 2 700 g 用 80% 的乙醇加熱回流提取三次，每次一小時，合并提取液，過濾，置于 70℃ 水浴蒸干，得乙醇提取物浸膏 140 g。浸膏用 10% 乙醇水溶液溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷萃取，得到石油醚部位(45 g)、乙酸乙酯部位 (40 g)、二氯甲烷部位(8 g)、剩余物(49 g)，不同萃取部位用改良羅氏培養(yǎng)基絕對濃度法進行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、二氯甲烷萃取部位能抑制結(jié)核桿菌，乙酸乙酯萃取部位活性更強，因此將乙酸乙酯萃取部位視為有效部位。

　　1. 3. 2 益母草乙酸乙酯萃取部位的活性跟蹤與分離

　　乙酸乙酯萃取部位用硅膠柱色譜(200 ～ 300 目)分離，干法裝柱，洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(4∶ 1 ～ 3 ∶ 2) 進行梯度洗脫，最后甲醇沖柱，經(jīng) TLC 檢測，合并相似成分，得到六個組分( Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D、Fr. E、Fr. F)(圖 1)。利用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，發(fā)現(xiàn)有效組分為 Fr. C(22-33)。

　　1. 3. 3 Fr. C 的活性跟蹤與分離

　　Fr. C 進行硅膠柱色譜(200 ～ 300 目) 分離，用二氯甲烷:甲醇(20∶ 1 ～ 15∶ 1)作洗脫劑進行梯度洗脫，得到四個組分(Fr. 1、Fr. 2、Fr. 3、Fr. 4)(圖 2)。

　　利用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，有效組分為 Fr. 2。Fr. 2 經(jīng)硅膠柱色譜多次純化，得到單體 YMC04(化合物 1，400 mg)。

　　1. 4 抗結(jié)核分枝桿菌測試絕對濃度法

　　改良羅氏培養(yǎng)基 40. 84 g，加入 12 mL 的甘油，加蒸餾水 600 mL 煮沸 5 ～ 10 min，115 ℃ 滅菌 20 min，待冷至 55 ℃左右時以無菌操作加入 1 000 mL 無菌攪勻的全蛋液，混勻，分裝在 15 mm × 150 mm 的試管，每管 5 mL [15]。稱取樣本，用二甲基亞楓 (DMSO)溶解，分別加入到含有改良羅氏培養(yǎng)基試管中，根據(jù)預(yù)實驗確定濃度，每個濃度做 3 管，平行做 2 次，陽性對照為異煙肼(2 μg /mL)，陰性對照為含 5% DMSO 的無藥培養(yǎng)基，放置成斜面，80 ℃ 下加熱滅菌 1 h，隔夜后相同條件下加熱滅菌 1 h，冷卻后接種 H37Rv 菌懸液(108 CFU/mL) 20 μL，使菌液由上往下分布在培養(yǎng)基斜面上，置 37 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 20 天。在培養(yǎng)期間，每天觀察記錄一次。結(jié)果判斷:菌落數(shù)低于5 個(含 5 個)視為有效，其中菌落0 ～1 個記“+ + +”，2 ～4 個記“+ +”，5 個記“+ ”，菌落數(shù)在6 個以上(含6 個)視為無效，記“-”。

　　2 結(jié)果

　　2. 1 活性跟蹤

　　采用改良羅氏培養(yǎng)基絕對濃度法對益母草乙醇提取物不同萃取部位進行活性測試，結(jié)果見表 1，可見活性最強的部位為乙酸乙酯萃取物。

　　乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠柱色譜分離，得到六個組分(Fr. A、Fr. B、Fr. C、Fr. D、Fr. E、Fr. F)，采用改良羅氏培養(yǎng)基進行活性跟蹤，確定 Fr. C 為活性部位(表 2)，其抑制結(jié)核桿菌的 MIC 值為 0. 4 mg /mL。

　　Fr. C 進一步進行硅膠柱色譜分離得到活性組分 Fr. 2，F(xiàn)r. 2 再經(jīng)硅膠柱色譜反復(fù)純化，得到活性單體化合物 1，經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)基進行活性測試，化合物 1 的 MIC 值為 80 μg /mL。

　　3 討論益母草常用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)閉經(jīng)，惡露不盡，瘡瘍腫毒等癥，是婦科疾病的常用藥。益母草的化學(xué)成分主要有生物堿(益母草堿、水蘇堿、益母草啶、益母草寧)、黃酮類、二萜類、環(huán)形多肽、阿魏酸等小分子化合物[17]。益母草堿的藥理作用較多，具有舒張冠脈、抑制 ATP 的合成、抑制炎癥因子的信號通路、抑制糖異生、促進子宮收縮等作用[18]。目前未見益母草堿抗結(jié)核桿菌活性的報道。

　　從結(jié)構(gòu)上看，益母草堿(3，5-二甲氧基-4-羥基- 苯甲酸 (4-胍基)-1-丁酯)屬于有機胺類生物堿，含有三個 N 原子，與一線抗結(jié)核藥物異煙肼類似，異煙肼同樣含有 3 個 N 原子，一個 N 組成吡啶環(huán)，另外兩個 N 原子形成肼基，而在益母草堿中，三個 N 原子以胍基的形式存在，由此我們推測，益母草堿抗結(jié)核桿菌機制可能與異煙肼類似。

　　在我們的初步試驗(尚未報道)中發(fā)現(xiàn)，益母草堿在大鼠子宮及其附件中的分布大于異煙肼，這一結(jié)果有待擴大樣本量進一步證實。同時我們擬對益母草堿進行結(jié)構(gòu)修飾，提高其抗結(jié)核桿菌活性并增加其在子宮中的分布，為治療子宮結(jié)核提供新的線索。

　　《益母草抗結(jié)核分枝桿菌成分的跟蹤分離》來源：《天然產(chǎn)物研究與開發(fā)》2018年3期，作者：韓立芬; 宋善敏; 甘夢蘭; 王仁鳳; 楊再昌。

《益母草抗結(jié)核分枝桿菌成分的跟蹤分離》

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