質(zhì)譜技術(shù)表征糖藥物結(jié)構(gòu)的前沿進(jìn)展

　　摘要：目前，小分子藥物研究已經(jīng)進(jìn)入平臺(tái)期，而大分子生物藥物迅速發(fā)展起來。糖藥物作為生物藥中尤為重要的一類，被廣泛應(yīng)用于腫瘤、心腦血管疾病等的預(yù)防和治療。然而無論骨架糖鏈還是修飾性糖鏈，都具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜且微不均一性的特點(diǎn)，這對(duì)現(xiàn)代分析技術(shù)提出了較高的要求。隨著軟電離技術(shù)、多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展以及分辨率和靈敏度的提高，質(zhì)譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于糖類藥物的分析和表征。對(duì)糖藥物、質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了簡要的介紹，并以多糖藥物和糖綴合物類藥物為例闡述了質(zhì)譜在糖藥物結(jié)構(gòu)表征方面的技術(shù)進(jìn)展，此外還就質(zhì)譜在糖藥物新藥及仿制藥物研發(fā)和注冊(cè)方面的應(yīng)用進(jìn)行了討論。

　　關(guān)鍵詞：質(zhì)譜;糖藥物;結(jié)構(gòu)表征

　　21世紀(jì)以來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活水平迅速提高，醫(yī)療條件大幅改善，傳統(tǒng)傳染性疾病如瘧疾、麻疹等的發(fā)病率逐年下降。同時(shí)，由于環(huán)境的污染與不合理的生活方式，以癌癥、糖尿病、心腦血管疾病等為代表的現(xiàn)代非傳染性疾病的發(fā)病率與死亡率正逐年攀升。現(xiàn)代疾病的復(fù)雜性和多樣性對(duì)藥物先導(dǎo)化合物的種類提出了更高的要求。糖藥物作為一類重要的生物大分子藥物，因其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)而遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于小分子藥物的發(fā)展。但近年來，隨著分析技術(shù)的發(fā)展，大量以糖類為先導(dǎo)化合物的新藥被發(fā)現(xiàn)，糖類藥物也因此成為了繼蛋白質(zhì)類藥物后另一個(gè)潛力無限的新藥寶庫。如2018年7月治療阿爾茨海默癥的新藥“甘露寡糖二酸”順利完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，這標(biāo)志著該藥的研發(fā)已邁過了最為關(guān)鍵的一步，也表明糖類作為一類新的先導(dǎo)化合物在未來藥品的研究中發(fā)揮著不可替代的作用[1]。

　　1 糖藥物與質(zhì)譜技術(shù)

　　廣義的糖藥物是指以糖結(jié)構(gòu)為骨架或以糖結(jié)構(gòu)為修飾的藥物。包括僅含糖分子的“多糖類藥物”(如肝素、甲殼素等)，作為多數(shù)藥用植物活性成分的“糖苷類藥物”(如強(qiáng)心苷、黃芪皂苷等)，以糖蛋白、糖脂為代表的“糖綴合物類藥物”(如單克隆抗體、人胎盤脂多糖等)，非酶糖基化反應(yīng)得到的“擬糖復(fù)合物”(如糖疫苗等)[2]。區(qū)別于小分子藥物，糖藥物的復(fù)雜性給其定性定量及安全性與療效的評(píng)估帶來了巨大的挑戰(zhàn)，如多糖類藥物中的低分子肝素具有高負(fù)電荷、分子量大、結(jié)構(gòu)不均一等特征[3]，糖綴合物類藥物中的單克隆抗體具有復(fù)雜的糖基化修飾，包括糖基化位點(diǎn)及糖型的多樣性[4]。傳統(tǒng)分析方法如高效液相色譜法難以對(duì)糖藥物復(fù)雜的組分實(shí)現(xiàn)基線分離，對(duì)分離組分的結(jié)構(gòu)解析也相對(duì)困難。紅外光譜法能對(duì)部分官能團(tuán)進(jìn)行歸屬，然而所能獲得的結(jié)構(gòu)信息有限。核磁共振波譜法盡管能獲得較為全面和細(xì)致的結(jié)構(gòu)信息，但其只能表征整體結(jié)構(gòu)而無法鑒定單個(gè)組分。而具有其他分析方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)將液相良好的分離能力和質(zhì)譜高分辨率、高靈敏度結(jié)合，可以完成對(duì)糖藥物各組分及其碎片分子量的測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其精細(xì)結(jié)構(gòu)的表征。

　　質(zhì)譜分析是一種通過測(cè)量離子質(zhì)荷比(質(zhì)量與電荷之比)從而確定質(zhì)量進(jìn)而推算分子結(jié)構(gòu)的分析方法。質(zhì)譜儀由進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器等部分組成，其中離子源和質(zhì)量分析器是核心部分。離子源包括軟電離和硬電離兩類。在糖藥物分析中廣泛使用的是軟電離方式，如電噴霧電離(electrospray ionization, ESI)和基質(zhì)輔助激光解析電離(matrix assisted laser desorption ionization, MALDI)[5-6]。質(zhì)量分析器可分為高分辨與低分辨兩類。由于糖藥物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，高分辨的質(zhì)量分析器如軌道阱質(zhì)量分析器(orbitrap)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(time of flight, TOF)等被廣泛應(yīng)用于其結(jié)構(gòu)的分析。通過軟電離源與高分辨的質(zhì)量分析器，可以確定糖藥物組分的精確分子量，從而計(jì)算其糖單元組成和數(shù)量、取代基情況等。如果需要對(duì)糖鏈的結(jié)構(gòu)進(jìn)行更深入的鑒定，如糖鏈的連接順序、連接位點(diǎn)、分支情況和取代基的具體位置等，則需要用到多級(jí)質(zhì)譜。在多級(jí)質(zhì)譜中，通過碰撞誘導(dǎo)解離(collision induced dissociation, CID)、電 子 轉(zhuǎn) 移 解 離(electron-transfer dissociation， ETD)及高能碰撞解離(higher-energy collisional dissociation, HCD)等不同碎裂方式使特定的母離子碎裂，再對(duì)碎裂得到的子離子進(jìn)一步解析，可實(shí)現(xiàn)糖類藥物的序列測(cè)定和同分異構(gòu)體的區(qū)分等。此外，三重四極桿質(zhì)量分析器(triple quadrupole)所 特 有 的 多 反 應(yīng) 監(jiān) 測(cè) 模 式(multiple reaction monitoring, MRM)通過過濾背景離子可顯著提高定量的選擇性和準(zhǔn)確度，適用于糖藥物關(guān)鍵組分的定量分析。由于質(zhì)譜技術(shù)可以很方便地與氣相色譜和液相色譜等技術(shù)實(shí)現(xiàn)聯(lián)用，更加促進(jìn)了其在糖藥物分析中的應(yīng)用。

　　2 質(zhì)譜在糖藥物結(jié)構(gòu)表征方面的技術(shù)進(jìn)展

　　2 .1 質(zhì)譜在多糖類藥物結(jié)構(gòu)表征方面的技術(shù)進(jìn)展

　　多糖類藥物根據(jù)所帶電荷可分為帶正電荷的多糖(如甲殼素)、帶負(fù)電荷的多糖(如肝素、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸等糖胺聚糖)以及中性多糖等。肝素(圖 1)是最具有代表性的多糖藥物，其全球市場(chǎng)規(guī)模超過 120 億美元 / 年。肝素由己糖醛酸(β-D- 葡萄糖醛酸或 α-L- 艾杜糖醛酸)和葡萄糖胺通過 1-4 糖苷鍵連接形成的二糖重復(fù)單元連接而成。己糖醛酸可能會(huì)發(fā)生 2-O- 硫酸化，而葡萄糖胺可能會(huì)發(fā)生 6-O- 硫酸化、3-O- 硫酸化、N- 硫酸化及 N- 乙?；８嗡刈鳛榭鼓幬锞哂谐^ 80 年的臨床使用史，為了提高其生物利用度、降低臨床副作用，之后又出現(xiàn)了各種低分子量肝素藥物。依據(jù)降解工藝的不同，低分子肝素可分為依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉、那曲肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等。不同的低分子肝素品種具有各自的結(jié)構(gòu)特征及臨床適應(yīng)證。

　　由于低分子肝素的組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，往往需要用到多種質(zhì)譜技術(shù)從不同的角度對(duì)其進(jìn)行分析，常用的策略包括自上而下分析(top-down)和自下而上(bottom-up)分析(圖2)。自上而下的分析指不經(jīng)降解處理直接對(duì)低分子肝素進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析，如Linhardt實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種基于親水相互作用色譜(HILIC)與質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析低分子肝素的完整糖鏈指紋圖譜，解析了各糖鏈組分的鏈長、末端結(jié)構(gòu)、硫酸基和乙酰基的取代數(shù)目等，并根據(jù)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算各組分的相對(duì)含量[7]。筆者課題組開發(fā)了反相離子對(duì)色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對(duì)依諾肝素鈉和那曲肝素鈣分別進(jìn)行了完整糖鏈的分析，共鑒定到140多種依諾糖鏈結(jié)構(gòu)和80多種那曲糖鏈結(jié)構(gòu)，還可以靈敏地檢測(cè)到產(chǎn)品中的副反應(yīng)產(chǎn)物[8]。利用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低分子肝素中糖鏈的直接測(cè)序[9]。自下而上的分析是指通過酶解或化學(xué)降解的方法把低分子肝素充分降解成基本的二糖組成單元或部分降解成寡糖片段，再用液相色譜質(zhì)譜法進(jìn)行分析。由于質(zhì)譜既可以檢測(cè)到?jīng)]有紫外吸收的組分，又可以發(fā)現(xiàn)沒有對(duì)照品的新結(jié)構(gòu)，可以鑒定到的低分子肝素衍生二糖或寡糖的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過以往的認(rèn)識(shí)。目前最全面的質(zhì)譜分析方法可以鑒定并定量約50種依諾肝素鈉的基本組成單元[10]。從肝素酶II降解的低分子肝素寡糖片段混合物中，也可以鑒定并定量超過40種寡糖片段，這些寡糖片段可以作為評(píng)價(jià)多糖序列的間接證據(jù)[11]。

　　2.2 質(zhì)譜在糖綴合物類藥物結(jié)構(gòu)表征方面的技術(shù)進(jìn)展

　　在糖綴合物類藥物中，糖蛋白藥物是尤為重要的一類。在糖蛋白藥物中，最具代表性的是以γ型免疫球蛋白G(IgG)為基礎(chǔ)的單克隆抗體類藥物。單克隆抗體(圖3)是由兩條輕鏈及兩條重鏈通過二硫鍵連接組成的四聚體，其中每個(gè)輕鏈由一個(gè)可變區(qū)(VL)和一個(gè)恒定區(qū)(CL)組成，而每條重鏈由一個(gè)可變區(qū)(VH)和3個(gè)恒定區(qū)(CH1、 CH2和 CH3)組成。連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)經(jīng)水解后可分為含有抗原結(jié)合位的Fab區(qū)和易結(jié)晶的Fc區(qū)[12]。大部分單克隆抗體的Fc區(qū)CH2處的Asn297氨基酸殘基上有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，此處的糖基化修飾位于兩個(gè)CH2之間，由于空間限制了其糖鏈分支的延伸，故該處最常見的糖型為雙天線結(jié)構(gòu)并大多伴有核心巖藻糖基化。約20%的單克隆抗體會(huì)在Fab區(qū)存在另外一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，如西妥昔單抗的CH1處 Asn88氨基酸殘基上就發(fā)生了N-糖基化[13]。另外單克隆抗體還可能發(fā)生O-糖基化修飾[14]。

　　由于單克隆抗體包括蛋白質(zhì)主體和糖鏈修飾兩部分，對(duì)其全面的結(jié)構(gòu)表征包括對(duì)蛋白質(zhì)的表征和對(duì)糖的表征。蛋白質(zhì)的全譜分析包括 ：蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定(完整分子量及輕鏈、重鏈的分子量)、氨基酸序列的測(cè)定、二硫鍵的位置及蛋白質(zhì)空間的結(jié)構(gòu)等[15-17]。對(duì)糖的表征包括糖基化位點(diǎn)的鑒定(N- 糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn))及糖型的表征。N-糖基化位點(diǎn)的鑒定可以借助糖苷酶，如采用β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切割糖苷鍵時(shí)，會(huì)留下一個(gè)GlcNAc 殘基附著在蛋白質(zhì)上，使肽段增加203Da的質(zhì)量標(biāo)簽[1 8]。而使用肽-N-糖苷酶(PNGase)在D2O中釋放完整糖鏈，會(huì)同時(shí)將天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化為天冬氨酸殘基，使肽段增加3Da的質(zhì)量標(biāo)簽[19]。隨后使用 LC-MS/MS分析檢測(cè)去糖基化后的質(zhì)量差異，就可以確定原始N-糖基化發(fā)生的位點(diǎn)。不同于N-糖基化位點(diǎn)，O-糖基化的發(fā)生位點(diǎn)難以預(yù)測(cè)，原因是O-糖鏈的核心結(jié)構(gòu)具有異質(zhì)性，目前還沒有通用的內(nèi)切糖苷酶被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其鑒定相對(duì)困難。Bai等[20]采用混合外切O-糖苷酶，部分移除O-糖肽絲氨酸和蘇氨酸上的糖鏈，并留下一個(gè)GalNAc殘基作為質(zhì)量標(biāo)簽，然后利用LC-MS/MS檢測(cè)203Da的質(zhì)量差異來確定O-糖基化位點(diǎn)。糖型的分析策略包括使用 PNGase 酶釋放糖鏈、固相萃取富集純化糖鏈、熒光標(biāo)記和液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)等步驟。如H enry等[21]報(bào)導(dǎo)了采用這一策略對(duì)曲妥珠單抗的糖型的分析。

　　3 質(zhì)譜在糖藥物新藥及仿制藥研發(fā)和注冊(cè)方面的應(yīng)用

　　3. 1 質(zhì)譜在新型糖藥物研發(fā)中的應(yīng)用

　　人們對(duì)糖分子結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子。近年來，隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，尤其是質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為開發(fā)新型糖藥物提供了有力的保證。巖藻糖化硫酸軟骨素是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的具有新藥前景的多糖，可以作為肝素類抗凝藥物的補(bǔ)充。這種多糖存在于海洋動(dòng)物海參中，其抗凝機(jī)制與肝素不同，為抑制內(nèi)源凝血通路，通過質(zhì)譜等技術(shù)可以鑒定這種糖鏈的基本結(jié)構(gòu)[22]。而通過尖端的離子回旋共振質(zhì)譜技術(shù)，可以更為精細(xì)地鑒定這類新型糖鏈的精細(xì)結(jié)構(gòu)[23]，從而為其成藥性研究提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，尤其是糖組學(xué)技術(shù)，是質(zhì)譜在新藥研究領(lǐng)域中的另一個(gè)重要應(yīng)用。人體內(nèi)超過 50%的蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生糖基化修飾，而與疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的生物標(biāo)志物蛋白的糖基化比例往往更高。基于質(zhì)譜技術(shù)的糖組學(xué)分析可以比較病人與健康人樣本間的差異，從而發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物糖蛋白，提供新藥開發(fā)的靶點(diǎn)[24]。除了結(jié)構(gòu)鑒定外，質(zhì)譜還可以用于大分子的空間相互作用分析。如Li等[25]利用氫氘交換質(zhì)譜技術(shù)分析了不同單克隆抗體對(duì)腫瘤標(biāo)志物糖蛋白糖基化修飾的不同響應(yīng)及相關(guān)的抗原表位，有助于指導(dǎo)單克隆抗體藥物的深入優(yōu)化。

　　3.2 質(zhì)譜在糖藥物仿制和報(bào)批方面的應(yīng)用

　　由于糖鏈的不均一性，在糖藥物仿制藥的結(jié)構(gòu)一致性評(píng)價(jià)時(shí)，很難采用小分子化學(xué)藥物的分析方法。通常需要更多地使用各種質(zhì)譜技術(shù)，盡可能全譜表征其整體結(jié)構(gòu)和各糖鏈組分結(jié)構(gòu)。以低分子肝素為例，2010年，Sanofi公司的依諾肝素鈉專利到期，隨后美國的Sandoz公司成功仿制了這一品種，并借助質(zhì)譜等分析技術(shù)證明了其仿制藥與原研藥在結(jié)構(gòu)上的一致性。美國FDA就這一事件出臺(tái)了低分子肝素仿制藥一致性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)意見，強(qiáng)調(diào)了應(yīng)對(duì)產(chǎn)品的完整糖鏈分布、二糖基本組成單元、寡糖指紋圖譜和糖鏈序列等方面進(jìn)行細(xì)致的結(jié)構(gòu)確證和比較。而滿足這些結(jié)構(gòu)分析要求，質(zhì)譜技術(shù)是不可或缺的[26]。單克隆抗體等糖綴合藥物的仿制和評(píng)價(jià)需要遵循生物相似性(biosimiliar)原則[27-29]。對(duì)于糖鏈修飾部分，需要通過質(zhì)譜技術(shù)來表征糖基化位點(diǎn)和糖型并與原研藥進(jìn)行比較。

　　4 總 結(jié)

　　隨著現(xiàn)代疾病的復(fù)雜化和多樣化，局限來源的先導(dǎo)化合物已經(jīng)不能滿足人們對(duì)疾病的預(yù)防和治療的需求，糖藥物作為一類新的先導(dǎo)化合物在未來人類疾病治療中起到不可或缺的作用。中國生物醫(yī)藥企業(yè)想要搶占藥物產(chǎn)業(yè)升級(jí)的先機(jī)，就應(yīng)重視糖藥物的研發(fā)和仿制。結(jié)構(gòu)鑒定和表征是糖藥物研發(fā)的一個(gè)瓶頸，而質(zhì)譜技術(shù)，尤其是糖的質(zhì)譜分析，需要非常強(qiáng)的專業(yè)性。因此建設(shè)專業(yè)化的糖分析質(zhì)譜平臺(tái)，培養(yǎng)更多的相關(guān)專業(yè)人才，建立更多的糖分析相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，將有利于推動(dòng)我國糖產(chǎn)業(yè)的技術(shù)變革和優(yōu)化升級(jí)。

　　期刊推薦：《質(zhì)譜學(xué)報(bào)》(雙月刊)創(chuàng)刊于1980年，由中科院北京科學(xué)儀器研制中心主辦?？俏锢?、化學(xué)、生物化學(xué)、材料學(xué)、核科學(xué)、地球科學(xué)、生命科學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科中質(zhì)譜法的新理論、新方法、新技術(shù)及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用研究成果，同時(shí)介紹質(zhì)譜學(xué)及其相關(guān)技術(shù)在上述前沿課題研究中的最新進(jìn)展。

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