巖青蘭化學成分及抗氧化活性

　　摘 要：為有效利用巖青蘭資源，測定了其不同極性萃取物中總酚和總黃酮的含量.結果表明，乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮含量最高，分別達到74.5mg/g和426.70mg/g.采用 LC-MS技術，從樣品中確定了圣草酚(eriodictyol)、komaroviquinone、胡麻素(pedalitin)、dracocequinoneA、gardeninB和薊黃素(cirsi-maritin)6個化合物.體外抗氧化分析表明，巖青蘭具有較強的抗氧化能力.

　　關鍵詞：巖青蘭;總酚;總黃酮;LC-MS分析;抗氧化

　　巖青蘭(Dracocephalumrupestre Hance)又名毛建草，是唇形科(Lamiaceae)青蘭屬植物.該植物為多年生草本，株高15～42cm，葉片三角狀卵形，邊緣具圓鋸齒;花期7-9月份，輪傘花序，花冠紫藍色，全草具香氣.在我國巖青蘭主要分布在河北、山西、青海、內蒙古和遼寧等地，生于海拔650～2400m 草原、草坡或疏林下 [1].

　　據《中藥大辭典》記載，巖青蘭可全草代茶，主治外感風熱、頭痛寒熱、咳嗽、黃疸性肝炎.除作為傳統藥材外，山西等地已將巖青蘭開發(fā)成茶飲.已有研究發(fā)現，巖青蘭同屬植物提取物具有抗氧化[2-3]、抗腫瘤[4]、抗高原缺氧[5]、保護心血管系統[6-7]等藥理作用.本研究對巖青蘭的化學成分進行了分析，并對其抗氧化活性進行了測定，以便為其合理開發(fā)利用奠定基礎.

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　本實驗所用的材料為巖青蘭地上部分，采于北京東靈山海拔2000m 左右處.實驗前將材料自然晾干，粉碎.

　　1.2 提取物的制備

　　將材料自然晾干后，用體積分數為95% 的乙醇進行提取，每次提取的時長為1周，重復4次.提取完成后合并提取液并進行抽濾，濾液通過旋轉蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)，得到總浸膏.留取部分總浸膏備用，其余部分用不同極性的溶劑進行萃取，所用溶劑分別為乙酸乙酯、石油醚和正丁醇，每種溶劑萃取5次.最后將得到的各層萃取物用旋轉蒸發(fā)儀在40～50 ℃條件下旋轉蒸發(fā)，自然晾干得到不同極性的萃取物.

　　1.3 樣品中總酚、總黃酮含量的測定

　　總酚測定：將不同的樣品配制成溶液，溶液的質量濃度為4mg/mL，取不同的樣品溶液各0.125mL，分別加入Folin-ciocalteu試劑1mL，2min后，再分別加入質量分數為10%的碳酸鈣溶液2mL，定容至10mL.在50 ℃、避光的條件下反應15min，采用紫外分光光度計在775.0nm 波長下測定其吸光度.總黃酮測定：將不同的樣品配制成溶液，溶液的質量濃度為4mg/mL，取不同的樣品溶液各0.5mL，分別加甲醇9.5mL，加質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min，再分別加質量分數為10%的硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，分別加入質量分數為4%的氫氧化鈉溶液10mL，定容至25mL，采用紫外分光光度計在503.3nm 波長下測定其吸光度.

　　1.4 LC-MS分析

　　采用柱子：ShimmadzuVPODScolumn(150mm×2.0mm，5μm).毛細管溫度為260℃，紫外檢測波長為280nm.分別用無水甲醇將乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物配制成適當質量濃度的溶液，進 樣 量 為20μL.溶劑：A 為體積分數0.01%甲酸水溶液;B為乙腈.流速1mL/min.乙酸乙酯層程序：0～30min，B為10%～50%，30～35min，B為50%～100%，35～45min，B為100%.正丁醇層程序：0～30min，B為10%～30%，30～35min，B為30%～100%，35～45min，B為100%.

　　1.5 DPPH 自由基清除率的測定

　　參照李建飛等[8]方法，用 多 道 移 液 槍 在96孔 板 中 分 別 加 入 不 同 的 樣 品 溶 液 100μL，再 加 入100μL60μmol/mL的 DPPH 標準溶液，加液后迅速避光，室溫下反應40min，用酶標儀在517nm 下測定吸光度.重復3次.用 Vc溶液作為陽性對照.1.6 ABTS自由基清除率的測定用多道移液槍將不同樣品溶液及對照品 Vc溶液各50μL加入96孔板，再加入150μLABTS，在30 ℃、避光條件下放置30min，通過酶標儀測定其吸光度，測定的波長為734nm.重復3次.

　　1.7 ·OH 自由基清除率的測定

　　用多道移 液 槍 將 不 同 樣 品 溶 液 及 對 照 品 Vc 溶 液 各 75μL 加 入 96 孔 板，再 分 別 加 入 硫 酸 亞 鐵(9mmol/L)、水楊酸-乙醇溶液(9mmol/L)和過氧化氫溶液(8.89mmol/L)各15μL，在避光、37 ℃恒溫條件下反應30min后，通過酶標儀在510nm 下測定吸光度.重復3次.

　　1.8 總還原力的測定

　　總還 原 力 的 測 定 采 用 FRAP 法.在 酸 性 條 件 下，抗 氧 化 物 能 夠 還 原 Ferric-tripyridyltriazine(Fe3+-TPTZ)產生 Fe2+ -TPTZ，這種物質呈藍色.通過酶標儀在593nm 波長下測定其吸光度即可計算出樣品中的總還原力.

　　用多道移液槍在96孔板中加入5μL不同質量濃度的硫酸亞鐵標準溶液，通過酶標儀在593nm 下檢測吸光度，繪制標準曲線.

　　用多道 移 液 槍 在 96 孔 板 中 分 別 加 入 FRAP 工 作 液 180μL，再 加 入 5μL 不 同 樣 品，以 0.15～1.5mmol/L的 Trolox作為陽性對照，空白對照加入5μL蒸餾水，輕輕搖勻.37 ℃孵育5min后通過酶標儀在593nm 下檢測吸光度.

　　2 結果與分析

　　2.1 總酚和總黃酮的含量

　　分別測出5個樣品的吸光度值，并將其代入標準曲線的線性方程Y=109.06x+0.0603(0.002mg/mL≤ x≤0.012mg/mL)中，計算出不同樣品中總酚質量濃度，在此基礎上計算在不同提取物中的總酚含量，結果見表1.

　　分別測出5個樣品的吸光度值，并將其代入標準曲線的線性方程Y= 0.4959x-0.0016(8μg/mL≤x≤ 48μg/mL)中，計算出不同樣品中總黃酮的質量濃度，在此基礎上計算不同提取物中的總黃酮含量(表1).

　　從表1可以看出，乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮的含量最高，分別為74.5mg/g 和426.70mg/g，其次是總浸膏，水層萃取物中總酚和總黃酮的含量最低，其含量分別為1.7mg/g和31.05mg/g.

　　2.2 LC-MS檢測結果

　　通過分析，在乙酸乙酯萃取物中檢測到了化合物1和2，在正丁醇萃取物中檢測到化合物3、4、5、6，如表2所示.

　　2.3 不同樣品對 DPPH 自由基的清除率

　　通過酶標儀分別測定了不同樣品對 DPPH 自由基的清除率，并與 Vc進行對比，結果如圖1.從圖1中可以看出，當樣品質量濃度為100μg/mL時，乙酸乙酯萃取物的活性較好，對DPPH 自由基清除率達到69.7%;當質量濃度上升到200μg/mL時，總浸膏、正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物對 DPPH 自由基清除率分別達到61.17%、65.02%和93.18%，對照品 Vc的 DPPH 自由基清除率為96.97%，乙酸乙酯萃取物的 DPPH 自由基清除率幾乎與 Vc相當.在不同樣品中，乙酸乙酯萃取物的 DPPH 自由基清除活性最高，其次是正丁醇萃取物、總浸膏，其IC50值分別為50.01、114.07和188.83μg/mL.水層和石油醚萃取物活性最低，其IC50值均在1000μg/mL以上.

　　2.4 不同樣品對 ABTS自由基的清除率

　　不同樣品對 ABTS自由基的清除率如圖2所示.

　　從圖2中 可 以 看 出，樣 品 質 量 濃 度 達 到100μg/mL 時，總 浸 膏、乙 酸 乙 酯 萃 取 物 和 正 丁 醇 萃 取 物 對ABTS自由基清除率均達到50%以上，分別為54.92%、70.34%和61.24%.當質量濃度上升到200μg/mL時，以上3個樣品對 ABTS自由基清除率分別上升為72.48%、89.61%和75.69%.不同樣品對 ABTS自由基清除效果依次為乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>總浸膏>水層萃取物>石油醚萃取物，其IC50值分別為43.62、59.86、82.61、258.40和336.94μg/mL

　　2.5 不同樣品對羥自由基的清除率

　　不同樣品對羥自由基(·OH)的清除效果有明顯的差異，其結果如圖3所示.從圖3 中 可 以 看 出，當 樣 品 質 量 濃 度 為 50μg/mL 時，乙酸乙酯萃取物對羥自由基清除 率均達到50.05 %.當樣品質量濃度為100μg/mL時，總浸膏、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物對羥自由基清除率分別為67.74 %、78.67%和59.81 %.當樣品質量濃度在200μg/mL時，乙酸乙酯萃取物對羥自由基清除率高達94.32%，與對照 Vc(99.14%)相當.不同樣品對羥基自由基清除效果依次為乙酸乙酯萃取物>總浸膏>正丁醇萃取物>石油醚萃取物>水層萃取物，其IC50值分別為44.27、59.79、66.95、103.31和330.99μg/mL.

　　2.6 不同樣品的總還原力

　　通過測定不同質量濃度硫酸亞鐵標準溶液的吸光度，繪制出標準曲線(圖4)，得回歸方程Y= 0.297x-0.0008(0.15mmol/L≤x≤1.5mmol/L，R2= 0.9998).

　　分別測出5個樣品的吸光度值，將所測樣品的吸光度值代入線性方程Y= 0.297x-0.0008中，計算出不同提取物中的抗氧化物質trolox[6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethyl-chroman-2-carboxylicacid)]的相對含量，見表3.

　　不同樣品中總 Trolox相對含量差異顯著，乙酸乙酯萃取物中總 Trolox相對含量最高，總浸膏和正丁醇萃取物次之，含量低的是石油醚和水層萃取物.

　　通過總酚含量與總還原力相關性分析，得出Y=0.6689x+3.1483(R2=0.9774)，詳見圖5.

　　圖6為總黃酮含量與總還原力相關性，Y=0.1026x-0.0961(R2=0.8535).

　　通過以上分析可看出，總酚含量和總黃酮的含量與trolox相對含量有顯著的正相關關系.trolox在6號碳的位置有1個酚羥基，正是該酚羥基的存在，賦予了trolox強大的抗氧化能力.trolox的相對含量代表了被測物質的總還原能力，根據以上結果可以得出，巖青蘭中總酚極大地決定了該植物提取物的抗氧化能力，總黃酮的含量對抗氧化能力影響也非常大.

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　　3 討論

　　本研究發(fā)現，巖青蘭乙酸乙酯萃取物中總酚和總黃酮含量最高，分別達到74.5mg/g和426.70mg/g.此外，還從中檢測到圣草酚等化合物.任冬梅[6]也曾從巖青蘭中分離到圣草酚，這與本研究結果相一致.

　　自由基具有很強的氧化性，能將細胞中的蛋白質和 DNA 等物質氧化破壞，最終導致蛋白質失活，引發(fā)癌變、老化等[9].為了尋找天然抗氧化劑，人們對不同藥用植物的抗氧化活性進行了研究，發(fā)現了一些抗氧化活性較強的植物，例如傳統中藥丹參[10]、甘草[11]、紅景天[12]等.Wang 等 [13]研究了華北藍盆花的抗氧化活性，發(fā)現其乙酸乙酯萃取物清除 DPPH 自由基的能力較好，IC50為8.47μg/mL.Dastmalchi等[14]研究發(fā)現，青蘭屬植物香青蘭的提取物也有很好的抗氧化活性，對自由基有一定的清除作用.

　　任冬梅[6]通過 DPPH 法鑒定了香青蘭和巖青蘭的自由基清除能力，發(fā)現在 B環(huán)上的3'，4'鄰二羥基取代的黃酮類化合物具有較好的抗氧化活性.已有研究表明，圣草酚能有效清除 DPPH 自由基，抑制自由基損傷生物大分子.

　　本研究表明，巖青蘭乙酸乙酯萃取物具有較強的抗氧化活性，當 其 質 量 濃 度 為200μg/mL 時，對 DP-PH、ABTS和·OH 自由基清除率達到93.18%、89.61%和94.32%.正是由于巖青蘭的乙酸乙酯萃取物中含有較多的總酚和總黃酮類物質，才使其具有較強的抗氧化作用.因此，巖青蘭可作為一種天然的抗氧化植物資源被開發(fā)利用.

《巖青蘭化學成分及抗氧化活性》

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