南方護(hù)理雜志淺析慢性中耳炎骨質(zhì)破壞

　　【摘 要】 【目的】 探討白細(xì)胞介素17(IL-17)、干擾素γ(IFN-γ)在不同類型慢性中耳炎(COM)中的表達(dá)水平及與骨質(zhì)破壞的關(guān)系。【方法】 用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)組37例慢性中耳炎病變組織(膽脂瘤中耳炎20例，非膽脂瘤中耳炎17例)和對(duì)照組18例(13例正常外耳道皮膚及5例正常中耳黏膜)中的IL-17、IFN-γ的表達(dá)?！窘Y(jié)果】 IL-17在膽脂瘤中耳炎、非膽脂瘤中耳炎、外耳道皮膚及中耳黏膜中的陽性表達(dá)指數(shù)分別為(81.6 ± 20.0)%、(43.3 ± 25.7)%、(4.7 ± 1.9)%和(5.6 ± 2.3)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);IFN-γ在膽脂瘤中耳炎、非膽脂瘤中耳炎、外耳道皮膚及中耳黏膜的陽性表達(dá)指數(shù)分別為(65.4 ± 24.0)%、(30.1 ± 24.5)%、(4.8 ± 1.8)%和(4.0 ± 1.6)%，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);慢性中耳炎病變組織中IL-17(r = 0.685，P < 0.001)、IFN-γ(r = 0.662，P < 0.001)與骨質(zhì)破壞程度均成正相關(guān)。【結(jié)論】 慢性中耳炎患者病變組織中的IL-17、IFN-γ表達(dá)水平的上調(diào)可能與該病骨質(zhì)破壞的發(fā)生有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 IL-17; IFN-γ; 慢性中耳炎; 骨質(zhì)破壞; 破骨細(xì)胞　醫(yī)學(xué)職稱論文

　　慢性中耳炎(chronic otitis media， COM)是常見的中耳炎性疾病，目前主要將其分為膽脂瘤型中耳炎及非膽脂瘤型中耳炎兩型。骨質(zhì)破壞是它們的基本病理特征之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示膽脂瘤型中耳炎骨質(zhì)破壞的發(fā)生率為80%，而在非膽脂瘤型中耳炎中也達(dá)到了10% ～ 20%的發(fā)病率[1]。然而目前關(guān)于骨質(zhì)破壞發(fā)生的確切機(jī)制仍不清楚，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)慢性中耳炎患者的局部病灶中有大量的炎性細(xì)胞侵潤，這些炎性細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)了破骨細(xì)胞的活化，而后者被認(rèn)為可能是中耳炎性疾病骨質(zhì)破壞的最終效應(yīng)細(xì)胞。因此，有學(xué)者推斷慢性中耳炎的骨質(zhì)破壞與局部病灶中的各種炎癥細(xì)胞及因子有密切關(guān)系[2-4]。白細(xì)胞介素17(interleukin17，IL-17)、干擾素γ(interferonγ，IFN-γ)分別是Th17、Th1的標(biāo)志性細(xì)胞因子，它們?cè)跈C(jī)體免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用，具有多種免疫活性，不僅可以作為強(qiáng)大的前炎癥因子激活局部的炎癥反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成而影響骨質(zhì)吸收。但目前有關(guān)于IL-17、IFN-γ與慢性中耳炎的研究相對(duì)較少，因此，本研究通過觀察IL-17、IFN-γ在不同類型慢性中耳炎中的表達(dá)特點(diǎn)，試圖探討它們與骨質(zhì)破壞的相關(guān)性。

　　1 材料與方法

　　1.1 病例資料

　　實(shí)驗(yàn)組37例，為2008年7月-2009年5月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院行改良乳突根治術(shù)并鼓室成形術(shù)并符合納入標(biāo)準(zhǔn)的慢性中耳炎患者，年齡18 ～ 66歲，病程10個(gè)月 ～ 40年，男24例，女13例;分為膽脂瘤組20例和非膽脂瘤組17例，其中膽脂瘤組的研究標(biāo)本為膽脂瘤型中耳炎的膽脂瘤和上皮下基質(zhì)組織，非膽脂瘤組為骨瘍型中耳炎的肉芽組織，對(duì)照組為13例外耳道上皮標(biāo)本(從上述37例患者隨機(jī)獲取)及5例正常中耳黏膜組織(從顳骨外傷骨質(zhì)患者行面神經(jīng)減壓術(shù)中獲取);全部標(biāo)本均經(jīng)過術(shù)后常規(guī)病理活檢得到證實(shí)。所有受檢者實(shí)驗(yàn)前2周內(nèi)均未全身或局部使用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　兔抗人IL-17、IFN-γ多克隆IgG抗體均購自SANTA CRUZ公司，Envision法免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色盒購自北京中杉生物公司?！　⑹灠竦臉?biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化后，用30 mL/L過氧化氫甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性;0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)95 ℃加熱，抗原修復(fù);滴加一抗(IL-17、IFN-γ多克隆兔IgG抗體)，工作濃度為1 ∶ 100;4 ℃過夜;滴加第二抗體，37 ℃孵育30 min; DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

　　陽性結(jié)果判定：陽性染色呈棕黃色，觀察其在各組標(biāo)本中表達(dá)的分布特點(diǎn)及其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)部位。高倍鏡(400倍)下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野， 計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)(N)及陽性染色細(xì)胞數(shù)(n)，并計(jì)算出每例單位視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)(∑N)及陽性細(xì)胞總數(shù)(∑n)，求出每例標(biāo)本的陽性指數(shù)(PI)，應(yīng)用公式PI = ∑n/∑N × 100%，取各視野陽性細(xì)胞表達(dá)的平均數(shù)作為陽性細(xì)胞表達(dá)率[5]。采用雙盲法觀察，由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科兩位技術(shù)員分別進(jìn)行。

　　1.3 骨質(zhì)破壞程度分級(jí)

　　以手術(shù)術(shù)中高倍顯微鏡下所見及影象學(xué)資料對(duì)37例患者進(jìn)行判斷分為3級(jí)：輕度，盾板和單個(gè)聽小骨破壞;中度，兩個(gè)或兩個(gè)以上聽小骨和鼓室蓋、乳突蓋的破壞;重度，聽小骨的完全性破壞和骨迷路、外耳道后壁以及面神經(jīng)骨管的破壞[6]。所有資料與2008年7月-2009年5月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科醫(yī)院獲取。

　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Mann-Whitney test、Kruskal-Wallis test和Spearman correlation test進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α = 0.05。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 IL-17的表達(dá)情況

　　IL-17陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，部分細(xì)胞核著色，20例膽脂瘤組織標(biāo)本和17例非膽脂瘤肉芽組織中均有表達(dá)，呈不同程度的高、中、弱表達(dá)。膽脂瘤組織標(biāo)本中IL-17陽性表達(dá)細(xì)胞分布于膽脂瘤上皮下基質(zhì)中，多為浸潤的炎性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)豐富，在肉芽組織中IL-17陽性表達(dá)細(xì)胞為侵潤的炎性細(xì)胞，兩者IL-17的陽性指數(shù)(PI)均值分別為(81.6 ± 20.0)%和(43.3 ± 25.7)%，與非膽脂瘤組肉芽組織相比，IL-17在膽脂瘤組織中的表達(dá)明顯增加(P = 0.001)。13例外耳道皮膚標(biāo)本中幾乎沒有IL-17陽性表達(dá)，僅在皮下組織中有散在幾個(gè)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞，PI為(4.7 ± 1.9)%。IL-17在膽脂瘤組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P < 0.001); IL-17在非膽脂瘤組肉芽組織中的表達(dá)亦高于對(duì)照組(P < 0.001); 3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);IL-17在中耳黏膜的PI為(5.6 ± 2.3)%，與膽脂瘤組織(P < 0.001)及非膽脂瘤組織(P < 0.001)相比，表達(dá)明顯減少;與外耳道皮膚組織相比，表達(dá)量無明顯差異(P > 0.05;圖1及圖2)。

　　2.2 IFN-γ的表達(dá)情況

　　IFN-γ陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色，部分細(xì)胞核著色， 20例膽脂瘤組織標(biāo)本和17例非膽脂瘤組肉芽組織中均有表達(dá)，呈不同程度的高、中、弱表達(dá)。膽脂瘤組織標(biāo)本中IFN-γ陽性表達(dá)細(xì)胞分布于膽脂瘤上皮下基質(zhì)中，多為浸潤的炎性細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)豐富，在肉芽組織中IFN-γ陽性表達(dá)細(xì)胞為侵潤的炎性細(xì)胞，兩者IFN-γ的陽性指數(shù)(PI)均值分別為(65.4 ± 24.0)%和(30.1 ± 24.5)%，與非膽脂瘤組肉芽組織相比，IFN-γ在膽脂瘤組織中的表達(dá)明顯增加(P = 0.002)。13例外耳道皮膚標(biāo)本中幾乎沒有IFN-γ陽性表達(dá)，僅在皮下組織中有散在幾個(gè)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞，PI為(4.8 ± 1.8)%。IFN-γ在膽脂瘤組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P < 0.001); IFN-γ在非膽脂瘤組肉芽組織中的表達(dá)亦高于對(duì)照組(P < 0.001); 三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);IL-17在中耳黏膜的PI為(4.0 ± 1.6)%，與膽脂瘤組織(P < 0.001)及非膽脂瘤組織(P < 0.001)相比，表達(dá)明顯減少;與外耳道皮膚組織相比，表達(dá)量無明顯差異(P > 0.05;圖1及圖2)。

　　2.3 IL-17、IFN-γ與骨質(zhì)破壞程度的相關(guān)性

　　對(duì)不同類型慢性中耳炎病灶中的IL-17、IFN-γ相對(duì)表達(dá)量與骨質(zhì)破壞程度間的關(guān)系進(jìn)行分析，詳見表1、表2。結(jié)果顯示在每一實(shí)驗(yàn)組，骨質(zhì)破壞程度不同級(jí)別下的IL-17、IFN-γ的陽性指數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05;圖3)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)不同級(jí)別之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05);進(jìn)一步行Spearman等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果顯示IL-17(r = 0.685，P < 0.001)、IFN-γ(r = 0.662，P < 0.001)與骨質(zhì)破壞程度密切相關(guān)，隨著IL-17、IFN-γ相對(duì)表達(dá)量的增加，骨質(zhì)破壞程度也隨著加重。

　　3 討 論

　　Hofbauer等[7]提出關(guān)于細(xì)胞因子對(duì)破骨細(xì)胞調(diào)控的收斂假說，認(rèn)為大多數(shù)上游細(xì)胞因子和激素最終都是通過對(duì)OPG/RANK/RANK的調(diào)控而影響活性破骨細(xì)胞池的大小。一旦一個(gè)或多個(gè)上游因子的變化，將導(dǎo)致RANKL與OPG平衡破壞，從而引起骨質(zhì)代謝的紊亂[8]。在慢性中耳炎骨質(zhì)破壞機(jī)制的研究中，也發(fā)現(xiàn)諸多細(xì)胞因子參與其中，如Akimoto等[9]發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤中TNF-α表達(dá)明顯增高，且廣泛性骨質(zhì)破壞的膽脂瘤中TNF-α含量明顯高于局限性骨質(zhì)破壞的膽脂瘤;Marenda等[10-11]研究顯示IL-6在中耳膽脂瘤表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)量與聽小骨鏈的破壞的關(guān)系極為顯著，但關(guān)于這些細(xì)胞因子是通過何種途徑調(diào)控OPG/RANK/RANK系統(tǒng)尚不明確。

　　3.1 IL-17與慢性中耳炎骨質(zhì)破壞的關(guān)系

　　隨著骨免疫學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子對(duì)于破骨細(xì)胞的調(diào)控及骨質(zhì)破壞的啟動(dòng)有重要作用。Kotake等[12]證實(shí)IL-17可以通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞前體及成骨細(xì)胞間的相互作用來激活破骨細(xì)胞的成熟，IL-17首先作用于成骨細(xì)胞，通過刺激COX-2促進(jìn)PEG2的合成，進(jìn)而誘導(dǎo)RANKL基因的表達(dá)，打破RANKL與OPG之間的平衡，啟動(dòng)骨質(zhì)破壞。另一方面，IL-17是Th17參與免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)因子，在疾病發(fā)展的各個(gè)階段，IL-17發(fā)揮其強(qiáng)大的前炎癥因子作用，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)。如Kuligowska等[13]發(fā)現(xiàn)IL-17以時(shí)間和劑量依賴方式誘導(dǎo)IL-1和TNF-α分泌;還有學(xué)者等[14]報(bào)道IL-17可以誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，而這些下游因子在骨質(zhì)破壞發(fā)生的不同階段發(fā)揮作用。以上研究結(jié)果表明IL-17是誘導(dǎo)骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵因子。目前關(guān)于IL-17與慢性中耳炎的研究尚屬空白，顧之燕等[15]指出慢性中耳炎是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)，T細(xì)胞及其細(xì)胞因子在慢性中耳炎的發(fā)病過程中起到了重要作用。結(jié)合本研究結(jié)果：IL-17在慢性中耳炎中的膽脂瘤組織和肉芽組織中均有不同程度的表達(dá)，與正常外耳道皮膚比較，表達(dá)顯著上調(diào); 而且IL-17(r = 0.685， P < 0.001)的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和骨質(zhì)破壞的程度成正相關(guān)。我們推斷IL-17可能是引起慢性中耳炎骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵因子，它作為上游調(diào)控因子，一方面直接影響RANKL與OPG之間的平衡，另一方面促進(jìn)其他細(xì)胞因子的表達(dá)，間接影響骨質(zhì)破壞的發(fā)生。

　　3.2 IFN-γ與慢性中耳炎骨質(zhì)破壞的關(guān)系

　　IFN-γ作為Th1的標(biāo)志性細(xì)胞因子，對(duì)于破骨細(xì)胞的調(diào)控一直存在爭議。Takayanagi等[16]報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中，IFN-γ可以通過快速降解RANK的銜接蛋白-TRAF6來干擾RANKL的信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的傳導(dǎo)，并且拮抗IL-17的作用來抑制破骨細(xì)胞的形成。而Gao等[17]在活體研究中發(fā)現(xiàn)IFN-γ是破骨細(xì)胞形成的潛在刺激劑，它可以上調(diào)MHC-Ⅱ抗原的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞的活化與增殖。而活化的T細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的RANKL和TNF-α等。他們認(rèn)為在活體內(nèi)， IFN-γ這種間接的促進(jìn)作用已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其對(duì)破骨細(xì)胞前體的抑制作用，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞的形成，出現(xiàn)骨質(zhì)破壞。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ在慢性中耳炎中的膽脂瘤組織和肉芽組織中均有表達(dá)，與正常外耳道皮膚比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IFN-γ的陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)和骨質(zhì)破壞的程度成正相關(guān)(r = 0.662，P < 0.001)。沈志忠等[18]用流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)膽脂瘤中耳炎患者外周血中IFN-γ的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與本研究相似，表明IFN-γ在慢性中耳炎骨質(zhì)破壞中起到了促進(jìn)作用。

　　3.3 本研究的局限性

　　目前已證實(shí)破骨細(xì)胞是慢性中耳炎骨質(zhì)破壞的最終作用細(xì)胞，諸多細(xì)胞因子參與了破骨細(xì)胞的活化，它們相互促進(jìn)，相互拮抗，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)通路。本研究結(jié)果表明慢性中耳炎病變局部的IL-17、IFN-γ可能作為關(guān)鍵的上游調(diào)控因子參與骨質(zhì)破壞的發(fā)生，為進(jìn)一步完善該網(wǎng)絡(luò)通路做了一些基礎(chǔ)工作。但Chole等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)在臨床膽脂瘤標(biāo)本中有活性的破骨細(xì)胞罕見，而在實(shí)驗(yàn)性膽脂瘤中卻可見大量活性破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的存在。本文亦未從破骨細(xì)胞的數(shù)量及活化程度與兩種因子進(jìn)行相關(guān)性分析，其主要原因主要有以下幾點(diǎn)[20]：①常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方式包括電鏡和光鏡的取材、觀察范圍有限，無法檢測(cè)出破骨細(xì)胞。本課題組通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)75例膽脂瘤標(biāo)本、63例慢性中耳炎肉芽組織及破壞的聽小骨進(jìn)行HE染色后，光鏡下觀察，僅發(fā)現(xiàn)2例膽脂瘤標(biāo)本中有破骨細(xì)胞。②破骨細(xì)胞作為一種瞬時(shí)細(xì)胞其生命周期相對(duì)較短，所以雖然觀察到骨質(zhì)破壞，但在進(jìn)行組織取材固定過程中，可能破骨細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)凋亡。③中耳膽脂瘤疾病過程包括急性及平穩(wěn)期，在疾病急性期所固定的標(biāo)本，則可能檢測(cè)到破骨細(xì)胞，反之則檢測(cè)不到。④標(biāo)本來源于需要手術(shù)的病人，這些病人多數(shù)已經(jīng)過藥物的保守治療，這些藥物會(huì)抑制破骨細(xì)胞。所以要直接檢測(cè)破骨細(xì)胞的數(shù)量及活性，在技術(shù)方面和病例選擇方面有一定難度。本實(shí)驗(yàn)雖未直接表明IL-17、IFN-γ與破骨細(xì)胞的關(guān)系，但是通過分析兩種因子和骨質(zhì)破壞程度呈正比，再結(jié)合IL-17、IFN-γ的生物學(xué)活性，能間接地從一定程度上說明兩種因子在中耳膽脂瘤中可能是通過調(diào)控破骨細(xì)胞的活性來參與骨質(zhì)破壞的形成。進(jìn)一步研究應(yīng)對(duì)一些相關(guān)影響因素進(jìn)行嚴(yán)格限制(如加大標(biāo)本量，嚴(yán)格區(qū)分患者有無治療，采用敏感性高的檢測(cè)方法等)。

　　3.4 小 結(jié)

　　總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明IL-17、IFN-γ參與了中耳膽脂瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，在骨質(zhì)破壞的形成過程中起到了重要的作用。因此我們可以推測(cè)在中耳膽脂瘤的保守治療中以IL-17、IFN-γ為靶點(diǎn)，阻斷兩者的作用，對(duì)減緩疾病的發(fā)展和并發(fā)癥的發(fā)生、減小手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和難度、改善預(yù)后并提高患者的生活質(zhì)量有一定的臨床意義。但目前有關(guān)IL-17、IFN-γ與慢性中耳炎的研究相對(duì)較少，本研究也僅僅從蛋白質(zhì)水平對(duì)IL-17、IFN-γ在慢性中耳炎中的表達(dá)進(jìn)行了粗淺的探討，要確切了解IL-17、IFN-γ在慢性中耳炎骨質(zhì)破壞中的具體作用及兩者間相互調(diào)控的機(jī)理，尚有待于更深入的研究。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　Lin YS， Lin LC， Lee FP. The prevalence of chronic otitis media and its complication rates in teenagers and adult patients [J]. Otolaryngol Head Neck Surg， 2009， 140(2)： 165-170.

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