外泌體作為疾病診斷標(biāo)志物及藥物載體的應(yīng)用前景

　　摘要 作為一種納米級(jí)別的囊泡，外泌體的相關(guān)研究近年來逐漸成為熱點(diǎn)。外泌體來源于細(xì)胞內(nèi)的多囊泡胞內(nèi)體，經(jīng)由細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外。由于來自特定細(xì)胞類型的外泌體含有多種特異性的蛋白質(zhì)和 microRNA，使其成為了可以廣泛用于疾病診斷及預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。相較于其他外源性藥物載體，外泌體具有更低的免疫原性，并能夠靶向作用于病變細(xì)胞。這使得由細(xì)胞天然產(chǎn)生或經(jīng)過人工改造的外泌體作為一種新興的藥物載體具有良好的發(fā)展前景。特別是近幾年，外泌體在臨床應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展?jié)摿Σ粩喃@得拓展，針對(duì)腫瘤、糖尿病、心腦血管疾病、神經(jīng)退行性病變等重大疾病，以外泌體為基礎(chǔ)的疾病診斷和藥物的研發(fā)都取得了快速的進(jìn)步。本篇綜述重點(diǎn)介紹了外泌體作為一種生物標(biāo)志物在疾病診斷和預(yù)后中的應(yīng)用，同時(shí)闡述了外泌體作為一種新興的藥物載體所具有的優(yōu)勢(shì)以及存在的問題。

　　關(guān)鍵詞 外泌體; 疾病診斷; 藥物載體

　　1 外泌體的生物學(xué)特征及功能

　　作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間通訊媒介，外泌體 ( exosomes) 的相關(guān)研究在最近幾年逐漸成為熱點(diǎn)。外泌體最早是從羊網(wǎng)織紅細(xì)胞培養(yǎng)上清中分離出來，隨后的研究確認(rèn)了這種膜泡的特征、分泌途徑及其重要功能[1，2]。外泌體是直徑為 30 ～ 100 納米的膜泡結(jié)構(gòu)，密度約為 1. 15 ～ 1. 19 g /mL[1，3]。外泌體的形成過程相對(duì)復(fù)雜[4]: 首先，在胞外環(huán)境刺激下，細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞，其細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷出芽形成一個(gè)封閉的囊泡，稱為早期胞內(nèi)體( early endosomes) 。隨后，早期胞內(nèi)體逐漸成熟為晚期胞內(nèi)體 ( late endosomes) 。在此過程中，其膜再次向內(nèi)出芽并脫落，形成一系列內(nèi)囊泡( intraluminal vesicles，ILVs) ，將細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中相應(yīng)的蛋白質(zhì)與核酸選擇性包裹其中。這種含有許多囊泡的胞內(nèi)體稱為多囊泡胞內(nèi)體 ( multi-vesicular endosomes，MVBs) 。多囊泡胞內(nèi)體與質(zhì)膜融合后，其中的內(nèi)囊泡被釋放至細(xì)胞外，從而形成外泌體。當(dāng)外泌體分泌之后，一般遵從以下 3 種通路與靶細(xì)胞互相作用: ( 1) 被鄰近的細(xì)胞捕獲 ( 或者被將它們分泌出去的細(xì)胞捕獲) ; ( 2) 被距離很遠(yuǎn)的細(xì)胞攝入; ( 3) 參與到系統(tǒng)循環(huán)并被其他組織吸收[5]。

　　無論哪種細(xì)胞釋放的外泌體都攜帶若干標(biāo)志性的蛋白質(zhì)分子[6]。例如，參與多囊泡胞內(nèi)體生物發(fā)生 的 分 子 TSG101 ( tumor susceptibility gene 101 protein) 和 ALIX( ALG-2 interacting protein X) 、熱休克蛋白 70 與 90( heat shock protein 70，HSP70; Heat shock protein 90，HSP90) 、膜聯(lián)蛋白 ( annexin V) 、Rab 家 族 蛋 白 質(zhì)、四次跨膜蛋白質(zhì) ( CD9，CD63， CD81) 等。外泌體中還存在一些與其細(xì)胞來源相關(guān)的特定蛋白質(zhì)，例如抗原呈遞細(xì)胞( B 細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞) 所釋放外泌體中含有Ⅱ類主要組織相容性復(fù)合體( major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC Ⅱ) ，或腫瘤細(xì)胞來源外泌體中含有腫瘤抗原，例如 MLANA / MART1( melanoma antigen recognized by Tcells 1) [1]。除了含有蛋白質(zhì)外，外泌體還攜帶諸如 mRNA、非編碼 RNA 包括 microRNA 分子等，并且將這些分子轉(zhuǎn)運(yùn)到靶細(xì)胞中。這一特點(diǎn)使得遺傳信息通過外泌體轉(zhuǎn)移到距離很遠(yuǎn)的靶細(xì)胞成為了可能。外泌體以上的這些性質(zhì)，為外泌體作為疾病診斷的分子標(biāo)記物，以及用于生物治療的藥物載體提供了廣泛的理論基礎(chǔ)[7]。

　　2 外泌體作為診斷標(biāo)記物的潛能

　　外泌體的特征之一是其中富集了其來源細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)或 miRNA[8]。此外，外泌體可以從血液、尿液、唾液、羊水、惡性腹水、支氣管肺泡灌洗液和母乳等體液中分離出來。這些特征是外泌體作為疾病 診 斷 和 預(yù) 后 的 潛 在 生物標(biāo)志物的研究起點(diǎn)[9，10]。

　　2. 1 外泌體所含 miRNA 作為診斷標(biāo)記物的應(yīng)用

　　miRNA 是一種小型 RNA 分子，廣泛參與細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，也存在于外泌體中[11]。當(dāng)機(jī)體被疾病侵染時(shí)，引起血液、組織液等體液中特定 miRNA 高度表達(dá)，這些 miRNA 能夠借助外泌體的保護(hù)，防止被體液中廣泛存在的核酸酶降解。而這一特點(diǎn)也使得通過檢測(cè)外泌體中特定 miRNA 的含量來診斷疾病成為了可能。此前，諸多研究都致力于將外泌體中的 miRNA 作為一種生物標(biāo)記物來診斷癌癥。例如，在鼻咽癌、胰腺癌等多種癌癥中，都有關(guān)于將外泌體攜帶的 miRNA 用以癌癥診斷的報(bào)告[12，13]。外泌體作為分子標(biāo)記物的潛力不僅限于腫瘤。近年來，越來越多的研究旨在揭示外泌體所攜帶的 miRNA 與肌肉、脂肪等其他組織所涉及疾病的相關(guān)性。例如，Mateescu 等[14] 研究發(fā)現(xiàn)，胰腺細(xì)胞釋放的外泌體所攜帶的 miR-15a，通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激增加糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生率。該研究進(jìn)一步指出，2 型糖尿病患者的胰腺細(xì)胞外泌體中的 miR-15a 可以作為糖尿病的并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜損傷等疾病的診斷標(biāo)記物。而在血液循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體攜帶的多種 miRNA 都能作為疾病診斷的分子標(biāo)記物。例如，血漿中的外泌體所攜帶的 miR126- 5p，在獲得性再生障礙性貧血和骨髓增生異常綜合征患者體內(nèi)有顯著的上調(diào)趨勢(shì)，其表達(dá)量越高，患者生命周期越短，可以作為診斷這類疾病預(yù)后的生物標(biāo)記物[15]。而在擴(kuò)張型心肌病引起的急性心力衰竭的患者血清外泌體中，存在著 miR-92b-5p 明顯上調(diào)的現(xiàn)象，并且與患者疾病的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)的趨勢(shì)，是急性心力衰竭診斷的潛在標(biāo)志物[16]。同時(shí)，血清外泌體所攜帶的 miR-122-5p、miR-196b-5p、 miR-301a-3p 和 miR-532-5p 在多發(fā)性硬化癥疾病患者中明顯下調(diào)。而同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在患者的外周血單 個(gè) 核 細(xì) 胞 ( peripheral blood mononuclear cell， PBMC) 所釋放的外泌體中。這 表 明，外 泌 體 中 miRNA 可能是預(yù)測(cè)多發(fā)性硬化癥復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物[17]。這些研究表明，諸多疾病都會(huì)引起細(xì)胞釋放的外泌體所攜帶的 miRNA 出現(xiàn)特異性表達(dá)上調(diào)/下調(diào)，而這些特點(diǎn)揭示了外泌體可以作為疾病診斷的潛在分子標(biāo)記物[18]。

　　2. 2 外泌體所含蛋白質(zhì)作為診斷標(biāo)記物的應(yīng)用

　　除了外泌體所含 miRNA 可以作為疾病診斷潛在的分子標(biāo)記物之外，在疾病進(jìn)展中的某些病理性高表達(dá)蛋白質(zhì)也會(huì)在外泌體中有所富集，使其能夠作為一種分子標(biāo)記物進(jìn)行疾病診斷[8，19]。例如 Tan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在女性妊娠期血漿中的外泌體所含有的組織金屬蛋白酶抑制因子 1( tissue inhibitor of metallopeptidase-1，TIMP-1) 、纖溶酶原激活物抑制因子 1 ( plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) 、胎盤生長(zhǎng)因子( placental growth factor，PLGF) 3 種標(biāo)記物能用于對(duì)先兆子癇的預(yù)測(cè)和篩查。與現(xiàn)有先兆子癇生物標(biāo)志物相比，外泌體生物標(biāo)志物具有更強(qiáng)的預(yù)測(cè)穩(wěn)定性，足以在低風(fēng)險(xiǎn)的普通妊娠期人群中進(jìn)行有效的先兆子癇篩查。在神經(jīng)退行性疾病方面， Sardar 等[21]研究指出，阿爾茨海默癥認(rèn)知功能的惡化與 β 淀粉樣蛋白在腦神經(jīng)元中的高表達(dá)有關(guān)，而在阿爾茨海默癥患者大腦的神經(jīng)元來源的外泌體中，存在 β 淀粉樣蛋白高度富集的現(xiàn)象。由于神經(jīng)元外泌體在血液等體液中易于分離，并且含有特異性標(biāo)記分子易于鑒定，因此，神經(jīng)元外泌體可作為阿爾茨海默癥的診斷標(biāo)記物。此外，在癌癥治療過程中，外泌體所攜帶的糖原磷酸化酶 ( glycogen phosphorylase，GP) 也可作為化療過程中多柔比星 ( Doxorubicin) 對(duì)心損傷的標(biāo)志物[22]。以上發(fā)現(xiàn)均指出，外泌體作為一種細(xì)胞外微囊泡，在諸多疾病的診斷和預(yù)后中都發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，外泌體在細(xì)胞間通訊所攜帶的諸多特異性蛋白質(zhì)和 miRNA，都為疾病 早 期 診 斷 提 供 了 潛 在 的 標(biāo) 記 物 和 靶點(diǎn)( Fig. 1A) 。

　　2. 3 以外泌體為標(biāo)記物的臨床檢測(cè)平臺(tái)的發(fā)展

　　將外泌體作為診斷標(biāo)記物的首要條件之一是建立一套準(zhǔn)確、快速和靈敏度高的臨床檢測(cè)平臺(tái)。一直以來，外泌體檢測(cè)平臺(tái)都是圍繞流式細(xì)胞術(shù)為核心，對(duì)外泌體表面一系列特異蛋白質(zhì)標(biāo)記分子進(jìn)行篩選和檢測(cè)[23]。而近年來，隨著外泌體在疾病診斷中的重要作用逐漸引起關(guān)注，對(duì)于外泌體的臨床檢測(cè)手段也取得了一系列創(chuàng)新性的發(fā)展。Guo 等[24]提供了一種基于微流控芯片進(jìn)行外泌體檢測(cè)的新思路。在疾病診斷和檢測(cè)方面，相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，這類芯片具有體積小、高通量和高精度的特點(diǎn)，更適用于個(gè)體化醫(yī)療。而 Lee 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，通過拉曼光譜學(xué)分析手段可將人血液來源的細(xì)胞外囊泡進(jìn)行分類，進(jìn)而對(duì)前列腺癌等癌癥進(jìn)行診斷。此外，針對(duì)由大腦分泌進(jìn)入血清中的外泌體，通過表面等離子 體 共 振 成 像 技 術(shù) ( surface plasmon resonance imaging，SPRI) 能對(duì)其表征進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)量[26]。而針對(duì)于外泌體的量化研究，Kabe 團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為 ExoCounter 的新型裝置，用于檢測(cè)各種類型癌癥患者血清中外泌體的確切數(shù)量，同時(shí)，對(duì)于外泌體中一些特異性標(biāo)記分子進(jìn)行量化檢測(cè)[27]。作者利用預(yù)先交聯(lián)在一個(gè)光盤表面的抗體去識(shí)別并結(jié)合外泌體表面抗原，從而將外泌體捕獲在光盤凹槽中，通過抗體偶聯(lián)的磁性納米珠進(jìn)一步標(biāo)記被捕獲的外泌體，并用光盤驅(qū)動(dòng)器對(duì)被標(biāo)記的外泌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。該系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度和線性度均高于 ELISA 或流式細(xì)胞術(shù)等傳統(tǒng)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確可靠的液體活檢?？傊?，以外泌體為核心的臨床檢測(cè)平臺(tái)正處于快速發(fā)展之中，未來有望準(zhǔn)確測(cè)定外泌體表面蛋白質(zhì)的分布情況，并通過外泌體追蹤其來源細(xì)胞的病理狀態(tài)，從而為建立高效的以外泌體為基礎(chǔ)的疾病診斷體系提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

　　3 外泌體作為靶向藥物載體的應(yīng)用

　　外泌體的內(nèi)源性及其納米級(jí)別的體積，加之在細(xì)胞通訊中的重要作用，使得外泌體作為藥物載體擁有著其他載體分子難以企及的兩大優(yōu)勢(shì)[28]。首先是其內(nèi)源性，使得外泌體能夠通過血液循環(huán)系統(tǒng)順暢地到達(dá)身體的各個(gè)組織與器官，并可在不引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的情況下釋放內(nèi)容物[29]。其次是對(duì)于疾病發(fā)生期間細(xì)胞釋放的外泌體，其成分發(fā)生一系列變化，使外泌體膜表面或者囊泡內(nèi)攜帶靶向識(shí)別病變細(xì)胞的蛋白質(zhì)，這也使得利用外泌體進(jìn)行靶向治療成為了可能[30]。總之，外泌體作為一種內(nèi)源性的靶向藥物載體，有著廣闊的應(yīng)用前景。

　　3. 1 天然產(chǎn)生的外泌體作為藥物治療疾病

　　部分細(xì)胞所自然產(chǎn)生的外泌體對(duì)于治療疾病有著巨大的潛質(zhì)。Dong 團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)，人血清外泌體在體外能恢復(fù)缺鐵性肌營(yíng)養(yǎng)不良細(xì)胞的細(xì)胞功能[31]。除此之外，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能通過促進(jìn)增殖，抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來介導(dǎo)軟骨修復(fù)[32]。同時(shí)，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，通過活化血小板衍生的生長(zhǎng)因子 D ( platelet derived growth factor D，PDGF-D) 來改善心肌細(xì)胞再生和促進(jìn)血管生成[33]。值得注意的是，外泌體作為一種納米級(jí)載體，可不經(jīng)修飾穿過血腦屏障。這使得將外泌體作為一種藥物載體治療部分腦損傷疾病成為了可能。Yang 等[34]研究指出，間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體可能用于治療創(chuàng)傷性腦損傷及其引發(fā)的神經(jīng)性炎癥。而 Yuan 等通過研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞來源的外泌體可以將大腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 ( brain-derived neurotrophic factor，BDNF) 輸送到腦神經(jīng)元中，并且這一現(xiàn)象隨著腦炎癥的加劇而增強(qiáng)。這一發(fā)現(xiàn)為治療神經(jīng)中樞疾病提供了一種潛在的載體[35]。而同樣作為載體的還有血紅細(xì)胞來源的外泌體，針對(duì)瘧原蟲侵染過后的人體，血紅細(xì)胞將數(shù)百種 miRNA 復(fù)合物通過外泌體轉(zhuǎn)移到寄生蟲內(nèi)，這為靶向消滅惡性瘧原蟲侵染提供了一種思路[36，37]。

　　4 問題與展望

　　外泌體作為一種新興的診斷標(biāo)記物及藥物載體，在應(yīng)用方面還存在著許多挑戰(zhàn)。目前，將外泌體作為疾病診斷的分子標(biāo)記物所存在的主要問題有兩個(gè): 一是傳統(tǒng)方法獲得的外泌體純度和得率都較低，難以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè); 二是目前缺少有效的快速檢測(cè)外泌體表征的技術(shù)方法。除此之外，外泌體在體外長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存的方法也有待優(yōu)化[43]。推薦閱讀：中醫(yī)活血化瘀法在婦科疾病中的臨床應(yīng)用

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