無機(jī)納米材料在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

　　摘要 自組織工程與再生醫(yī)學(xué)概念提出以來, 組織工程與再生醫(yī)學(xué)特別是骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展. 支架材料作為骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)三要素之一扮演著至關(guān)重要的角色. 10余年來, 大量的研究工作圍繞支架材料展開. 納米生物材料尤其是無機(jī)納米生物材料, 具有優(yōu)良的機(jī)械性能和生物相容性, 成為制備骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)支架材料的理想選擇, 呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景. 本文對(duì)近年來無機(jī)納米材料, 包括羥基磷灰石、硅基納米材料, 含碳納米材料及幾種金屬納米材料在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述.

　　關(guān)鍵詞 無機(jī)納米材料, 骨組織工程與再生醫(yī)學(xué), 支架

　　在全球范圍內(nèi), 眾多骨損傷患者每年都遭受著病痛的折磨, 而造成骨損傷的原因很多, 如年齡、運(yùn)動(dòng)、疾病和創(chuàng)傷等. 自19世紀(jì)以來, 自體骨或異體骨材料體內(nèi)移植一直是人們用來修復(fù)大面積骨損傷的方法, 然而這些材料自身就存在著不可忽視的缺陷. 自體骨移植雖易被患者接受, 但是會(huì)給患者造成新的創(chuàng)傷和痛苦, 異體骨材料雖然取材方便, 但是存在疾病傳播和免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn), 從生物安全上很難達(dá)到令人滿意的修復(fù)效果[1~3]. 骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)在這種背景下應(yīng)運(yùn)而生, 給骨修復(fù)帶來新的期盼. 骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)是通過“智能”操控種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子來模擬天然骨組織的微環(huán)境從而促進(jìn)骨母細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)形成, 最終實(shí)現(xiàn)骨重建[4]. 其中支架材料是骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵, 同時(shí)也是研究力量投入最多的方向, 一方面其作為載體將種子細(xì)胞及生長(zhǎng)因子運(yùn)送至損傷部位, 另一方面支撐著新骨的生長(zhǎng). 目前, 在臨床治療中人工制備的材料用作硬組織修復(fù)材料越來越廣泛, 因此硬組織修復(fù)材料成為了臨床需求的最大領(lǐng)域之一, 而材料研發(fā)成為生物醫(yī)用材料發(fā)展最重要的一個(gè)方向. 理想的人工骨修復(fù)替代材料應(yīng)具備以下特性[5]: (1) 優(yōu)良的機(jī)械性能; (2) 良好的可加工性和臨床操作性; (3) 較好的生物學(xué)特性或可降解性; (4) 良好的骨傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性. 人工骨修復(fù)材料的發(fā)展按其演變歷程簡(jiǎn)單分為3個(gè)階段[6]. 第1階段: 20世紀(jì) 60~70年代, 主要是第一代生物材料, 如部分骨衍生材料、金屬材料、生物陶瓷等, 這一代生物材料對(duì)宿主的應(yīng)答較小; 第2階段: 20世紀(jì)80年代, 生物活性玻璃(Na2O-CaO-P2O5-SiO2)、羥基磷灰石(HA)等, 并研究出了生物體可吸收材料, 最終被再生出的組織替代, 如HA/聚乳酸(PLA)復(fù)合材料等. 第2代生物材料缺乏生物化學(xué)刺激的響應(yīng)性, 因此降低了其使用功能, 縮短了其壽命; 第3階段: 20世紀(jì)90年代至今, 各類復(fù)合材料特別是無機(jī)復(fù)合材料取得了長(zhǎng)足發(fā)展, 并且隨著納米學(xué)、材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步, 納米材料和仿生材料已經(jīng)成為骨修復(fù)材料的主要發(fā)展趨勢(shì).

　　納米骨修復(fù)材料是一類由人工合成、具有多種優(yōu)良理化特性(如機(jī)械強(qiáng)度高、比表面積大等)和生物學(xué)特性(如生物相容性好、可降解、能誘導(dǎo)骨細(xì)胞和血管生長(zhǎng)等)的新型骨修復(fù)材料. 近年來, 用于骨組織修復(fù)的主要有無機(jī)材料(羥基磷灰石、納米陶瓷、無機(jī)金屬等)、納米聚合物、納米仿生骨等. 其中, 無機(jī)材料因其具有強(qiáng)度好、加工方便、較好生物學(xué)特性等優(yōu)點(diǎn)使其具有廣闊的應(yīng)用前景[7~9]. 另外, 由于天然組織或者器官是通過細(xì)胞與納米尺度的細(xì)胞外基質(zhì)相互影響而形成的, 那么納米材料的生物仿生性及生化特性對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)組織重建至關(guān)重要. 為了較好模擬細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu), 無機(jī)材料被設(shè)計(jì)成不同形貌, 如納米纖維、納米管、納米顆粒及水凝膠等, 用于細(xì)胞外基質(zhì)的重組[10]. 本文以無機(jī)納米材料為重點(diǎn), 詳細(xì)介紹了羥基磷灰石納米材料、硅基納米材料、碳納米材料及多種無機(jī)金屬納米材料在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用.

　　1 納米羥基磷灰石在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

　　納米羥基磷灰石(nanohydroxyapatite, nHA)是天然骨骼中主要的無機(jī)成分, 是一種具有代表性的生物活性材料. nHA具有良好的骨傳導(dǎo)性、生物活性、骨結(jié)和性等特點(diǎn)成為良好的骨修復(fù)替代材料. 近10 年來, nHA作為人工骨材料在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中逐漸興起. 研究人員致力于改進(jìn)nHA合成策略和加工方法, 使nHA的功能多樣化, 應(yīng)用范圍廣泛化. 各種各樣的 nHA相繼出現(xiàn), 如單一的nHA支架、nHA的復(fù)合材料等, 而研究這些材料的性能和應(yīng)用成為當(dāng)今的主題.

　　1.1 單一nHA支架

　　在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中, 人們將HA做成不同結(jié)構(gòu)的支架材料來研究其對(duì)蛋白吸附和細(xì)胞行為的影響. nHA的微孔和介孔結(jié)構(gòu), 為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的吸附提供了可能的位點(diǎn), 影響細(xì)胞在材料表面黏附和組織生成. Zhu課題組[11]研究表明多孔的nHA有利于低分子蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的吸附, 特別是孔徑為 20 nm的nHA具有很強(qiáng)的纖維蛋白和胰島素吸附能力. 另外, nHA支架材料表面的粗糙程度對(duì)骨細(xì)胞的活性、黏附及分化也具有很大的影響. Iwamoto等人[12]通過將nHA和多聚物混合煅燒得到HA支架. 光滑材料表面由nHA聚集而成, 其晶格間距在微米級(jí)別; 而呈凹凸材料的表面由nHA聚集后煅燒得到, 晶格間距在納米級(jí)別. 骨細(xì)胞在光滑材料表面的黏附性能要顯著好于在凹凸表面. nHA的結(jié)晶度和溶解度也會(huì)影響吸附蛋白質(zhì)的濃度、pH及介質(zhì)的離子濃度. John等人[13]研究顯示, 低溶解度的nHA表面有助于成骨細(xì)胞(MG-63)的早期附著、貼壁和偽足延展. 而 β-磷酸三鈣則會(huì)在培養(yǎng)基中發(fā)生溶解, 導(dǎo)致培養(yǎng)基的低Ca, Mg和堿性磷酸酶(ALP)水平, 以及高P水平, 其表面的細(xì)胞也呈碎片化. 但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng), nHA和磷酸三鈣均產(chǎn)生抑制細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)的作用. 其原因可能是β-磷酸三鈣會(huì)快速溶解釋放出磷酸根和鈣離子, 而Ca2+則會(huì)再從培養(yǎng)基中沉淀到β-磷酸三鈣上, 從而導(dǎo)致磷灰石結(jié)晶度的相變. 另外, nHA的不同Ca和P的比例對(duì)成骨分化也有著顯著的影響. 通過酸刻蝕技術(shù), 發(fā)現(xiàn)30%磷酸蝕刻可以有效地改變 Ca/P比, 并且可以加速成骨細(xì)胞MC3T3-E1的初始黏附, 增殖和分化[14]. 通過研究成骨細(xì)胞對(duì)普通nHA 和鈣缺陷nHA兩種材料的生物效應(yīng), 發(fā)現(xiàn)其對(duì)成骨細(xì)胞的活性和ALP的產(chǎn)生均有促進(jìn)作用, 鈣缺陷nHA 的成骨分化能力要顯著高于普通nHA[15]. 單一nHA 支架的粒徑對(duì)骨細(xì)胞的生物學(xué)功能也起到重要的調(diào)控作用. Cai等人[16]研究不同粒徑的nHA對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和骨肉瘤細(xì)胞的影響, 結(jié)果表明 nHA促進(jìn)MSCs的增殖、黏附, 抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng), 尤其是尺寸為20 nm的顆粒作用效果最佳. 認(rèn)為小粒徑的nHA顆粒更易于促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化及生物礦化, 進(jìn)而加速骨的修復(fù). 我們課題組通過水熱法合成了3種不同形貌和尺寸的缺陷發(fā)光 HA納米/微米粒子對(duì)小鼠原代成骨細(xì)胞(OBs)的生物效應(yīng), 發(fā)現(xiàn)其通過胞內(nèi)和胞外兩條途徑共同作用促進(jìn)OBs礦化. 短棒(直徑為25 nm, 長(zhǎng)度為30~50 nm)和長(zhǎng)棒(直徑為25 nm, 長(zhǎng)度為70~110 nm)通過大胞飲和穴樣內(nèi)陷途徑進(jìn)入OBs, 定位于溶酶體, 在酸性環(huán)境下釋放出Ca2+, 為細(xì)胞礦化提供了Ca2+源. 而棒狀HA自組裝成的微米級(jí)刺球(直徑為5~6 μm)則無法進(jìn)入細(xì)胞[17]. 不過細(xì)胞外的3種nHA顆粒均可以作為礦化核, 同樣促進(jìn)原代成骨細(xì)胞的礦化.

　　為了模擬支架降解后產(chǎn)生的微小納米粒子對(duì) BMSCs成骨分化的影響. 本課題組[18]合成出長(zhǎng)約100 nm、寬約40 nm的長(zhǎng)棒狀結(jié)構(gòu)的nHA, 以模擬支架降解后產(chǎn)生的微小納米粒子對(duì)BMSCs成骨分化的影響. 研究發(fā)現(xiàn)nHA被細(xì)胞內(nèi)吞后進(jìn)入溶酶體, 在酸性環(huán)境中逐漸分解出磷酸根離子, 磷酸根離子進(jìn)入到線粒體中與二磷酸腺苷(ADP)結(jié)合產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷(ATP), ATP分解產(chǎn)物腺苷與膜上A2b腺苷受體結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶(AC), 從而促進(jìn)ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷(cAMP), 最終激活環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶 (AcAMP/PKA)信號(hào)通路以促進(jìn)BMSCs的成骨分化. 機(jī)理如圖1所示, nHA對(duì)骨分化分子機(jī)制的探討為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù).

　　為了研究nHA對(duì)體內(nèi)骨修復(fù)的作用, 研究工作者建立了系統(tǒng)、科學(xué)的分析方法用于評(píng)價(jià)nHA對(duì)骨細(xì)胞分化、骨修復(fù)及骨再生的能力. Zhu等人[19]建立了新西蘭大白兔雙橈骨缺損模型, 對(duì)比植入nHA材料和不植入組對(duì)骨修復(fù)的影響, 結(jié)果顯示, nHA的植入促進(jìn)了骨愈合能力, 且在誘導(dǎo)骨性上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 另一個(gè)體內(nèi)研究實(shí)例是將nHA和微米級(jí)別的HA移植到骨缺損位點(diǎn), 3~12周后發(fā)現(xiàn)兩者誘導(dǎo)的骨形成和血管生成潛能與小梁骨相當(dāng), 沒有顯著性差異. 但是, 12周后移植nHA材料的部位可觀察到明顯的骨內(nèi)生長(zhǎng). 上述研究證明nHA能夠模擬骨小梁, 在整形外科手術(shù)應(yīng)用中具有巨大的潛力. 但是, 傳統(tǒng)單一的HA 機(jī)械性能較差, 主要表現(xiàn)在臨床應(yīng)用中承載力低, 這便極大地限制了它的應(yīng)用范圍[20].

　　1.2 HA/聚合物/細(xì)胞因子復(fù)合材料

　　傳統(tǒng)的HA具有機(jī)械性能差、脆性高、韌性差等缺點(diǎn), 為了改善其力學(xué)性能, Bonfield等人[21]受到天然骨有機(jī)成分可增強(qiáng)無機(jī)成分機(jī)械性能的啟發(fā), 最先提出了生物陶瓷/聚合物復(fù)合材料的概念, 在HA中摻入聚苯乙烯制備出類似骨基質(zhì)的HA復(fù)合材料. 該材料顯著提高了HA的機(jī)械性能, 增加了韌性及生物活性. 另外, HA中摻入可降解聚合物, 如膠原纖維、蠶絲蛋白、聚乳酸、凝膠、殼聚糖等制備出的HA/復(fù)合材料已經(jīng)進(jìn)入臨床前期的研究階段. 每種聚合物的性能不同, 對(duì)于改善HA機(jī)械性能的程度也有所不同[22]. 膠原蛋白是天然骨組織中最豐富的聚合物蛋白, HA中摻入膠原蛋白為細(xì)胞提供更多的活性位點(diǎn), 提升材料的可降解性, 進(jìn)而加快新骨的再生. 然而, 由于膠原蛋白存在潛在的抗原性和病原體傳染性, 而且成本較高, 因此限制了它的應(yīng)用范圍[23]. 明膠作為膠原蛋白的替代物, 具有多個(gè)整合素位點(diǎn), 它沒有免疫原性, 對(duì)細(xì)胞的黏附起到關(guān)鍵作用. 此外, 支架材料上負(fù)載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)和表皮生長(zhǎng)因子等對(duì)于提高骨誘導(dǎo)性和局部血液運(yùn)輸性能起到良好的促進(jìn)作用[24~26]. 有學(xué)者提出鍶(Sr)元素可能在骨骼發(fā)育和骨修復(fù)中發(fā)揮重要作用[27~29], 近年來引起了眾多學(xué)者的興趣和關(guān)注. 目前, Sr被摻雜入許多生物活性材料中, 彌補(bǔ)了現(xiàn)有生物活性材料在成骨誘導(dǎo)性和降解性等方面的不足, 實(shí)現(xiàn)了骨修復(fù)生物材料的多功能性, 在骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中得以廣泛應(yīng)用. Hao等人[30]采用化學(xué)沉淀法合成了一種粒徑在600~800 nm的鍶摻雜納米羥基磷灰石(nano-SrHA), 與nHA相比, 100 μg/mL nano-Sr-HAP (鍶/磷的摩爾比1.67)顯著增強(qiáng)了成骨細(xì)胞黏附、增殖和細(xì)胞活力, 而且增強(qiáng)了MSCs細(xì)胞的ALP活性, 是nanoHAP組的2.18倍, 證實(shí)鍶具有骨誘導(dǎo)的特性. 結(jié)果表明在納米羥基磷灰石中引入鍶元素后, 其性能得到明顯改善, 可以用于修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨折引起的骨缺損. 本課題組[31]之前采用仿生礦化的方法在聚乳酸多孔支架的表面沉積摻鍶的nHA(摻雜Sr的比率為 20%), 通過沉積Sr-HA有效改善聚乳酸的疏水性, 緩解聚乳酸降解產(chǎn)生的酸性, 并且通過摻入Sr來增加聚左旋乳酸(PLLA)的成骨性能, 其成骨性能為單一 PLLA的2.04倍(圖2).

　　生物陶瓷/生物聚合物復(fù)合材料具有較好的孔隙率, 較優(yōu)的力學(xué)性能和生物特性是人工骨材料的理想選擇[32]. 近年來, 納米殼聚糖復(fù)合生物材料在組織工程與再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用引起廣泛的關(guān)注. 與單一的殼聚糖支架相比, nHA/殼聚糖復(fù)合支架的孔隙率高達(dá)95%, 孔徑為20~60 μm, 且具有良好的生物相容性[33]; 另外, nHA/殼聚糖復(fù)合材料具有良好的礦化能力, 表現(xiàn)在形成穩(wěn)定的HA, 且促進(jìn)細(xì)胞ALP的表達(dá)[34]. 文獻(xiàn)報(bào)道, nHA/殼聚糖纖維支架能夠誘導(dǎo) BMSCs的成骨分化, 并促進(jìn)MSCs的黏附和增殖, 在分子水平上, 上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá), 如I型膠原蛋白、ALP、骨鈣素、骨涎蛋白等基因[35]. Tang等人[36] 研究認(rèn)為天然HA/殼聚糖復(fù)合材料能夠與硬骨組織很好地相容, 并誘導(dǎo)骨形成, 因此該材料作為骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)中的人工骨移植物和支撐材料具有巨大潛力. 另外, Zhang課題組[37]利用靜電紡絲技術(shù)制備的HA/殼聚糖復(fù)合納米纖維具有類似天然骨纖維結(jié)構(gòu), 該材料摻入生物聚合物可提高材料的機(jī)械性能, 而nHA的摻入有助于成骨細(xì)胞的黏附和增殖. 體內(nèi)研究同樣證明了nHA促進(jìn)骨的形成與再生[38]. Fricain等人[39]對(duì)比摻雜或不摻雜nHA的具有直鏈結(jié)構(gòu)的天然淀粉和葡聚糖的骨修復(fù)潛能. 結(jié)果顯示, 摻入nHA的復(fù)合物支架誘導(dǎo)形成磷灰石層, 有利于形成皮下致密組織、致密礦化物及骨移植位點(diǎn)早期骨的再生. 另一個(gè)異位移植的研究表明在功能化的多孔納米磷酸鈣/鈦合金支架上接種骨膜細(xì)胞, 并將其移植到骨缺損部位, 可以觀察到大量的新骨生成[40]. 除此之外, 將干細(xì)胞及生長(zhǎng)因子與nHA預(yù)培養(yǎng), 然后將其移植到兔顱骨缺損模型中, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過移植 6和12周后觀察到29.45%和44.55%新骨區(qū)的形成. 因此, 將干細(xì)胞特別是人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(骨再生的金標(biāo)準(zhǔn))預(yù)培養(yǎng)在nHA支架上能夠極大的提升骨再生, 并已經(jīng)成功應(yīng)用到臨床. 劉昌勝團(tuán)隊(duì)[41]在鈣磷基納米材料上有著深厚的研究, 認(rèn)為磷酸骨鈣水泥(CPC) 作為不同形式磷酸鈣的混合物同樣對(duì)骨修復(fù)行為有重要的影響. 劉昌勝課題組[42]報(bào)道了由無水磷酸四鈣和磷酸二鈣混合而成的CPC能夠與HA晶體形成水合物, 該材料具有較低結(jié)晶度和較高的水溶性, 使 CPC納米晶體具有較好的機(jī)械性能和較高的生物吸收性能, 促進(jìn)相關(guān)成骨細(xì)胞體內(nèi)礦化及HA/膠原蛋白基質(zhì)的形成. 該團(tuán)隊(duì)報(bào)道的CPC首次運(yùn)用在國(guó)內(nèi)臨床上. 此外, 該團(tuán)隊(duì)的另外一項(xiàng)研究認(rèn)為多孔β-磷酸三鈣(β-TCP)具有較好的生物相容性和骨傳導(dǎo)性, 但缺乏穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能, 限制了其在骨修復(fù)中的應(yīng)用. 基于此問題, 該團(tuán)隊(duì)將β-TCP與生物可降解 的聚乳酸(PLA)和聚己內(nèi)酯(PCL)雜合形成β-TCP/ PGS介孔支架材料, 該支架具有多孔互通結(jié)構(gòu)和較好的機(jī)械性能, 提高了相關(guān)骨細(xì)胞的穿透性、增殖能力及礦化能力.

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