環(huán)介導等溫擴增法在食品安全檢測領(lǐng)域的應用

　　摘要：近年來各類型食品安全事件頻發(fā)，社會上下對于食品安全問題也愈發(fā)重視。根據(jù)各類型食品安全事件來看，食源性致病菌是引起食品安全問題的主要因素。目前在我國檢測食源性致病菌的主要手段為細菌分析、培養(yǎng)、生化鑒定等工作，該方法操作周期較長，并且檢測手段十分繁瑣，在檢測過程中往往只能檢測一種病菌，并且得出檢測報告的時間長達4~7d，基于此新型食源性致病菌檢測手段的研究至關(guān)重要。等溫擴增法在此情況下誕生，該方法因為對儀器要求不苛刻，核酸擴增高效、特異性好等優(yōu)點迅速成為食品安全行業(yè)食源性致病菌的檢測手段。文章從環(huán)介導等溫擴增法技術(shù)原理到其與新技術(shù)（包括橫向試紙法（Lateralflowdipstick,LFD），表面增強拉曼光譜（surface-enhancedRamanscattering,SERS），微流控芯片技術(shù)（micro-fluidics,MF））結(jié)合方法在微生物快速檢測領(lǐng)域的應用進行論述，并對其在微生物快檢方面的前景進行展望。

　　關(guān)鍵詞：等溫擴增法；致病菌；微生物快檢

　　根據(jù)世界衛(wèi)生組織的相關(guān)調(diào)查可知，有關(guān)食品中的有害病源微生物等高達200余種，每年在全球范圍內(nèi)大約200多×104人的死亡都與食品安全有關(guān)，其中食源性致病菌是導致各種食品安全問題的主要原因。在我國，雖然沒有專門針對食源性致病菌的診斷與報告，但是根據(jù)食品安全事故的發(fā)生情況來看，每年大約有4800×104人都會因為食品問題前往醫(yī)院進行診治，其中超過12×104的患者會因為食品安全入院治療，3000余人會直接死于食源性疾病，由此可見,食源性致病菌的危害不可小覷,對于食源性致病菌的快速檢測技術(shù)普及尤其迫切，等溫擴增法因為對儀器要求較低，已廣泛應用于DNA擴增的檢測和診斷。例如，許多病原體，如病毒、真菌、細菌和寄生蟲都可以使用LAMP進行檢測，其他生物源，如轉(zhuǎn)基因動植物都可以作為LAMP的檢測對象。其具備核酸擴增高效、特異性好等優(yōu)點有望成為食品安全行業(yè)食源性致病菌的重要檢測手段。

　　1技術(shù)原理

　　環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedistemperatureamplification,LAMP)是一種簡單、快速的方法，不需要昂貴的設(shè)備即可擴增和檢測目標序列，只需要一個溫度控制的加熱塊或水浴進行等溫放大反應，需要采用一對外引物和一對內(nèi)部引物，對目標基因的6個特定區(qū)域進行識別，然后利用BstDNA聚合酶在恒溫條件下參與反應以完成目的基因的擴增。在目標序列當中，2個引物能夠組成一個互補序列，并且組成的互補序列會形成可啞鈴狀結(jié)構(gòu)，使得擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)指數(shù)增長，在此過程中，通過添加2個額外環(huán)引物的方式，加快該反應的進行。

　　2等溫擴增法的衍生技術(shù)應用現(xiàn)狀

　　通常對LAMP擴增產(chǎn)物傳統(tǒng)檢測方法包括肉眼觀察、凝膠電泳分離顯色法、實時濁度、實時熒光等，相比新方法，傳統(tǒng)方法具有靈敏度低或存在抑制放大現(xiàn)象等弊端，因此新的LAMP擴增產(chǎn)物檢測技術(shù)應用研究越發(fā)廣泛。如橫向試紙法、表面強度拉曼、微流控芯片技術(shù)等。

　　2.1橫向試紙法（Lateralflowdipstick,LFD）

　　LFD主要采用的是膠體金作為標記物，借助核酸等溫擴增技術(shù)快速、便攜等優(yōu)勢，核酸等溫擴增-LFD技術(shù)在病原微生物的檢測，天津市疾控預防中心研究者將環(huán)介導等溫擴增與橫向擴增相結(jié)合流試紙用于檢測布魯氏菌，并建立了一個快速布魯氏菌快速檢測方法?？偝绦驎r間僅需80min即可特異性檢測布魯氏菌，對純菌培養(yǎng)的檢測靈敏度達到5.4x100CFU/mL。LAMP-LFD方法能夠快速、特異地檢測布魯氏菌，且具有簡便、經(jīng)濟、直觀的優(yōu)勢。

　　早在2014年，寧波大學生物與海洋科學系王瑞娜等為了減少全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)嚴重的經(jīng)濟損失，建立了基于環(huán)介導等溫擴增和側(cè)流聯(lián)合的豬鏈球菌視覺檢測試紙方法，該研究采用LAMP-LFD快速檢測豬鏈球菌，整個檢測過程僅需40min，比常規(guī)PCR檢測時間縮短了2h。對豬鏈球菌純菌的檢出限為8.70x101CFU/mL(1.74CFU/reaction)。比LAMP高10倍，比常規(guī)PCR高100倍且具有良好的重復性。因此，LAMP-LED是一種準確、省時、簡便的檢測方法，可用于現(xiàn)場檢測。

　　劉露及農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室等多個研究團隊建立了環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條檢測草魚呼腸孤病毒的方法，并與實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)進行對比。從LAMP擴增到LFD結(jié)果判讀共需50min，比qPCR檢測縮短近1h。

　　以上研究表明，LAMP和物美價廉的試紙條結(jié)合檢測致病菌不僅解決了單獨使用LFD靈敏度較低的缺點，也更加突出了核酸等溫擴增技術(shù)快速、方便的優(yōu)勢。LAMP-LFD技術(shù)在致病菌檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速且涉及面廣使得LAMP-LFD技術(shù)受到越來越多專業(yè)人士的青睞，其進一步的研究開發(fā)依然非常迫切。

　　2.2表面增強拉曼光譜（surface-enhancedRamanscattering,SERS）

　　表面增強拉曼光譜是使用拉曼活性金納米探針檢測細菌的DNA。結(jié)合LAMP擴增目標DNA，用金納米粒子組成的金納米探針進行標記，用特異性的探針修飾，使SERS能夠檢測到目標DNA。

　　ShehataDM等研究人員開發(fā)了一種集成的檢測方法，將環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)和表面增強拉曼光譜(SERS)結(jié)合起來檢測沙門氏菌，此檢測方法的靈敏度比傳統(tǒng)的PCR方法高100倍。值得注意的是，這項技術(shù)可以對腸道鏈球菌的目標DNA進行高度特異性檢測，并將其與密切相關(guān)的細菌或非特異性污染的DNA區(qū)分開來，使其比標準LAMP技術(shù)更準確可靠，同時研究驗證了LAMP-SERS法在牛奶樣品中檢測腸桿菌的適用性。LAMP-SERS具有較高的特異性和敏感性，在快速檢測不同食源性致病菌和其他微生物污染物方面有極大的潛力。

　　2.3微流控芯片技術(shù)（micro-fluidics,MF）

　　微流控芯片是一種在20世紀80年代興起的能夠精準操做控制的微尺度流體技術(shù)。其將化學分析儀器微型化與集成化，盡可能地把分析設(shè)備的功能聚集到芯片上。

　　JUHepeng等人建立LAMP微流控芯片快速檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的方法。用儀器或肉眼對結(jié)果進行評估，用標準菌株測試了芯片的敏感性和特異性，用污染樣品對芯片的敏感性進行了第二次驗證。結(jié)果表明，該芯片具有較高的靈敏度和特異性，三種病原菌檢測靈敏度均可達到102CFU/mL。藥科大學生命科學與技術(shù)學院研究者通過設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)、優(yōu)化進樣模式及檢測方式，實現(xiàn)了病原微生物核酸提取、擴增與檢測一體化，并具備多重檢測、定量檢測等功能。以期為病原微生物的快速篩查提供更多的方案思路，提升公共衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)魅拘约膊〉姆揽啬芰Α?/p>

　　朱亞光與其同事探討恒溫擴增微流控芯片技術(shù)快速篩查關(guān)節(jié)結(jié)核感染的應用價值，應用恒溫擴增法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法對19例疑似關(guān)節(jié)結(jié)核感染患者標本進行菌群鑒定，借助共焦濾波技術(shù)，熒光染料技術(shù)將標本的核酸通過恒溫擴增法使結(jié)果量化，同時將標本核酸結(jié)果比對陰性對照，陽性對照的核酸結(jié)果以此鑒定結(jié)果準確性。結(jié)果顯示恒溫擴增法檢測出13例陽性樣品，陽性率為68.42%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測出7例陽性樣品，陽性率為36.84%；由此得到恒溫擴增微流控芯片熒光檢測核酸技術(shù)可快速、準確、簡便地檢測可疑關(guān)節(jié)結(jié)核中結(jié)核分枝桿菌復合群，可作為診斷篩查手段。

　　秦奎偉將環(huán)介導等溫擴增的微流控芯技術(shù)應用在病原微生物沙門氏菌的快速檢測鑒定中，成功實現(xiàn)了對沙門氏菌的快速檢測鑒定。其研發(fā)的新型環(huán)介導等溫擴增微流控芯片具備體積小、耗樣量少、分析快、反應條件溫和、可視化檢測等優(yōu)點，可為食源性病原菌的快速檢測提供一種理想的方法。

　　3環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在檢測領(lǐng)域應用前景

　　目前，LAMP技術(shù)已經(jīng)被應用于多種真菌、病毒、細菌以及分枝桿菌等病原微生物的診斷。該方法操作簡單，儀器設(shè)備依賴性低，可快速、特異地檢測出病源微生物，尤其是LAMP-SERS分析具有較高的特異性和敏感性，具有快速檢測不同食源性致病菌和其他微生物污染物的潛力。微流控芯片技術(shù)是使用微管道進行實驗反應和樣本檢測等，具有微型化、集成化等特點。根據(jù)通道的設(shè)計，可以在芯片上產(chǎn)生所需的微環(huán)境條件，利用微流控芯片技術(shù)可以實現(xiàn)短期內(nèi)數(shù)十甚至上百例樣本的同時鑒定。LAMP技術(shù)結(jié)合一些新技術(shù)改變了傳統(tǒng)檢測方法中的諸多不足，有望成為微生物現(xiàn)場快速檢測的常規(guī)技術(shù)手段。

　　參考文獻：

　　[1]李秀梅,梁智選,李穎,等.環(huán)介導等溫擴增技術(shù)與橫向流動試紙條法快速檢測布魯氏桿菌[J].食品與生物技術(shù)學報,2017(12):50-56.

　　[2]劉露,李偉哲,肖勤.環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條檢測草魚呼腸孤病毒方法的建立[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2018,41(02):99-104.

　　舒沿沿，鄭菲

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